课题：2019 BOKU-Vienna
主要内容：
布鲁里溃疡是由溃疡分枝杆菌引起的传染病，引起这种疾病的罪魁祸首为霉菌内酯。这种细菌代谢物会削弱宿主的免疫反应，从而导致病变和组织死亡。对于这种疾病，使用靶向抗生素进行早期治疗对于完全康复至关重要，所以该课题组着眼于诊断工具的开发，希望能够快速简单地实现对布鲁里溃疡的诊断。检测的基本原理为RNA适配子结合霉菌内酯后其构象会改变，该课题组进而探索霉菌内酯与适配子的特定相互作用，寻找具有检测溃疡分枝杆菌潜力的RNA适配子，实现对溃疡分枝杆菌的检测。
关键词：布鲁里溃疡，诊断，RNA适配子，霉菌内酯
1 课题背景
该课题组针对的疾病是一种被忽视但其实在热带地区影响较大的热带病，一种在非洲和南美洲部分地区难以检测的疾病——布鲁里溃疡。布鲁里溃疡是由溃疡分枝杆菌引起的传染病，引起这种疾病的罪魁祸首为霉菌内酯，这种细菌代谢物会削弱宿主的免疫反应，从而导致病变和组织死亡。虽然布鲁里溃疡的死亡率很低，但许多治愈的患者不仅表现出皮肤的持久变形，而且表现出骨骼的持久变形。毫无疑问，关注这种被忽视的疾病是有意义的。
对于这种疾病，使用靶向抗生素进行早期治疗对于完全康复至关重要，所以该课题组着眼于诊断工具的开发。根据需求，该课题组需要找到一种可靠，廉价和简单的检测方法，不需要专业人员，设备齐全的实验室和漫长的检测时间。因此该课题组开始深入研究布鲁里溃疡的致病因子及其生产者，并研究诊断中潜在的新方法。了解到霉菌内酯是布鲁里溃疡的致病因子，并且它是一种大环内酯，于是该课题组利用一种称为适配子的RNA，如果存在霉菌内酯，RNA配子会改变其构象。基于这个原理，该课题组开发了他们的检测系统。
2 核糖开关
该课题组对大肠杆菌菌株DH10B进行遗传修饰，将其设计成在存在溃疡分枝杆菌的情况下就会产生特定信号，示意图如下（图1）。该系统能够通过霉菌内酯与适配子序列特异性结合来检测霉菌内酯。当存在霉菌内酯时，应在测试微生物中诱导发生颜色反应，实现快速而清晰的检测。电路中还应加入信号增强器，以提高检测限。
图1
该检测系统的关键为适配体核糖开关的设计。没有信号输入时，适配子序列与终止子序列结合形成发夹结构，RNA聚合酶上的蛋白质与发夹结合，从而停止转录，核糖开关此时处于关闭模式；如果存在霉菌内酯，发夹结构就会打开， RNA聚合酶转录出信号分子mRNA。该课题组根据基于发卡结构的核糖开关设计了两种回路。
第一种回路（图2）：
适配体结合霉菌内酯后，组成型启动子诱导LuxI和LuxR的表达，LuxI-LuxR复合物诱导Lux诱导型启动子表达更多LuxI（表达LuxI可以进一步放大信号）和报告蛋白——蓝色色素蛋白（amilCP）。同时LuxI产生的分子N-酰基高丝氨酸内酯（AHL），AHL可以被释放到环境中并被其他细胞接收，激活更多Lux启动子。绿色荧光蛋白（GFP）由LacI / T7启动子控制，将乳糖添加到培养基中，GFP将被表达，该回路用作系统的可行性控制。
图2
第二种回路（图3）：
霉菌内酯与适配子结合后组成型启动子诱导时T7-聚合酶的表达，随后T7-聚合酶诱导LuxI的表达，其与组成型启动子诱导的LuxR形成LuxI-LuxR复合物。这种复合物诱导Lux诱导型启动子，激活了蓝色色素蛋白（amilCP）的表达。信号放大的方式与第一种回路的方法相同。同时该表达系统含有阿拉伯糖启动子。通过将阿拉伯糖添加到培养基中，将诱导绿色荧光蛋白的表达，该回路用作可行性控制，证明整个系统是具有检测活力的。
图3
由于该课题组信号放大的方法借助了群体感应，所以该课题组另外构建了一个没有群体感应模块的系统（图4），以防万一这个检测系统的某些部分不起作用。这个系统由组成型启动子诱导时T7-聚合酶的表达，并通过T7-Promtor进一步诱导amilCP的表达，同时阿拉伯糖诱导的GFP信号回路也存在于该系统中。
图4
该课题组的实验结果证明由于霉菌内酯与特定适配体序列的结合诱导核糖开关启动，该核糖开关对霉菌内酯具有高度特异性。此外，该系统产生的信号是一个简单的视觉读数，读取信号时只需人眼观察即可。最重要的是，该检测系统对于霉菌内酯的检测限显着降低。该课题组希望对他们的系统作进一步的改进，包括一个更详细的上调和信号增强机制，使得一个霉菌内酯分子的存在并且与一个细胞中的一种适配体的结合后，就可以诱导信号输出，进一步降低他们的检测限。
3 课题结果
该课题组创建了一种霉菌内酯核糖开关，该开关在转录水平上工作 。他们的适配体是从论文中选取的，最终对比了多篇文献后，该课题组选择了最适宜的适配体序列（适配体3683）并设计了多个固有端接方案，之后他们将适配体序列添加到启动子和RBS中间以创建复合部件。将适配体放置在启动子和RBS之间非常重要，因为DNA的发夹结构可以在转录之前阻止RNA聚合酶结合到RBS上，适配子结合目标后，发卡结构打开，RNA聚合酶得以与RBS结合；为了测量该系统的泄漏GFP 被添加到复合部件的下游。
在不添加霉菌内酯的情况下测量GFP产生，可以在体内研究该系统的泄漏情况。在37°C下孵育15小时后，测量未添加霉菌内酯时系统的荧光，以及测量试剂盒中的荧光素标准品，以将核糖开关的净平均荧光转换为每个细胞分子的荧光。将来自未添加霉菌内酯时系统的算术净平均荧光4733.22放入曲线方程中，以计算OD600处320 nM的浓度=3.65, 这相当于每个细胞大约66，000个荧光分子。
该课题组经过实验发现，霉菌内酯的诱导在体内不起作用，因此，该课题组利用了myTXTL® Sigma 70 Master Mix试剂盒对他们的系统进行了无细胞的测试。在无细胞条件下的测试表明，霉菌内酯适配子核糖开关可以在无细胞系统上发挥作用，因为该课题组们在用霉菌内酯诱导后观察到了GFP的产生。
总结来说，该课题组设计了一种基于核糖开关的检测方法，检测结果可以用肉眼观察。核糖开关使用了基于适配体的T7-聚合酶和T7-启动子控制下游基因的表达。
4 Human Practice
来自不同利益相关者的见解和反馈从一开始就强烈影响了该课题组项目的发展。在调查了布鲁里溃疡研究和它在国际中的地位之后，该课题组联系了医学科学专家，医疗保健提供者，分子生物学家，伦理学家，社会科学家和前患者，以讨论和微调他们的系统。该课题组展示了他们是测试套件和手册，它们是根据与专家和实验室团队的交流精心起草的。
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