IGEM文献分享 Cell Reports: 一种适用于环境分离的耐药性菌株的基因编辑技术

文献标题：Native CRISPR-Cas-Mediated Genome Editing Enables Dissecting and Sensitizing Clinical Multidrug-Resistant P. aeruginosa

DOI号：10.1016/j.celrep.2019.10.006

关键词：铜绿假单胞菌；耐药性；CRISPR-Cas

摘要：

利用铜绿假单胞菌的内源I-F型CRISPR-Cas系统，建立的一种适用于其临床/环境分离的耐药性菌株的高效且原位的基因编辑技术

1.背景

AMR：Antimicrobial resistance，耐药性

MDR：multidrug-resistant，多重耐药性

铜绿假单胞菌是一种分布范围广的典型的多重耐药性病原菌，它本身就能抵抗很多种药物，并且它从外界获得耐药性的能力也很强。铜绿假单胞菌的基因组很大（6.4 Mbp)并且多变，因此，用在典型铜绿假单胞菌上的基因编辑系统对临床/环境分离出的具有多重耐药性的铜绿假单胞菌不太适用。并且，常常有成簇的抗药性标志性序列（marker）出现在临床的MDR菌株的基因组和可移动元件上，这些marker被发现对细菌的抗药性水平具有重要的影响，于是，靶向这些maeker是很有效且必要的。

研究表明，在AMR 铜绿假单胞菌中，有70%具有I-F型CRISPR系统。之前也有用细菌的内源性CRISPR系统来原位编辑致病菌的成功案例，于是作者也尝试用这个办法来对MDR铜绿假单胞菌编辑。

研究对象：

一种MDR铜绿假单胞菌，PA154197

PA154197性质特点：

i.与另一种高危细菌ST175有类似的抗性

ii.有native I-F CRISPR-Cas Locus

以下展示研究结果。

2. 对PA154197内源性CRISPR系统进行功能性分析

PA154197具有典型的I-F完整系统：完整的Cas蛋白和array（P.S.它的不同的repeat之间只有一个碱基的差异；spacer几乎都是32bp，并且很多是噬菌体的同源序列）。

Target gene：mexB基因，编码内膜组分，是一种AMR基因

Spacer的选择：之前的研究认为，按5’-protospacer-GG-3’的相对位置选取protospacer、并且以GG为PAM是比较合理的，但近期有人又建议，以guide-centric（5’-CC-3’）比target-centric(5’-GG-3’)更合理，于是就按5’-CC-protospacer-3’的相对位置来设计spacer。

3.验证mexB的敲除水平

（1）为了验证mexB敲除能力和修复能力，所使用/构建的质粒：

质粒pAY5211：空载质粒，具有卡那霉素抗性基因和Ptat启动的lux（luminescence，荧光素）基因，作为对照组。

构建质粒pAY5233：在有卡那霉素抗性的pMS402骨架的lux基因上游用强启动子Ptat表达靶向mexB的array序列，执行敲除mexB任务的质粒，称为targeting plasmid。当mexB被剪切后，细菌genome常常会紊乱，导致自身的死亡；

构建质粒pAY5235：将一个1kb的donor序列插入到pAY5233上，该序列由mexB的上游和下游的500bp的同源臂组成。质粒pAY5235称为editing plasmid。若mexB被剪切出口子，在一些菌中，mexB的这两段同源臂会和mexB同源重组，同源重组后这个gene就被修复好了，不会阻碍genome的正常工作，使得pAY5235本身可以稳定存在，菌落呈现荧光状态。

（2）检验基因敲除水平和功能性质粒对已编辑细胞的修复能力

实验步骤：向菌中转pAY5211（对照）、pAY5233（targeting plasmid）和pAY5235（editing plasmid），通过菌落克隆的荧光状态判断质粒转化水平。

实验结果和结论：

i.比较转化pAY5211和pAY5233的两组：pAY5211组中表达有荧光素的阳性克隆多，pAY5233组中几乎不存在表达有荧光素的阳性克隆，因此说明pAY5211的转化成功率比pAY5233高的多，进一步证明pAY5233组中的菌内发生了“detrimental chromosome cleavage”，导致细菌难以存活；这个结果说明，靶向mexB的基因敲除成功并且敲除水平较高。

ii.把转化pAY5235的组和前两组比较：pAY5235组出现了少量具有荧光的阳性克隆，说明部分细菌在mexB被敲除后进一步进行了同源重组、将genome修复，因此细菌可以正常存活，进而正常表达卡那霉素抗性和荧光素——这个实验证明了：由于这个CRISPR系统执行的基因敲除而给基因组带来的破坏是可以被修复的，也就是说，使用可编程质粒对细菌进行多轮编辑是可行的。下面那张在试管培养的图同样是在证明这一点。

（3）此外，本研究还表明，当target gene小于1kb时，敲除的成功率会>90%。如下图所示：

我的理解就是，这个实验是以mexB基因内的不同长度的区域当作不同的target gene，通过判断不同长度区域被完全剪切的效率来判断不同长度的target gene的剪切成功率。下面这个实验就在判断mexB内具体有多长被切掉了。原理是，Cas2/3剪切target gene后会剩下来长短不一的序列，用不同的引物去PCR，看能P下来的片段是完整长度的还是中间一段被剪切掉后两端剩下的长度，P下来完整长度就说明敲除失败，P下来是只有两侧剩余的长度就说明敲除成功。

由图可以看出，和array靶向范围（32bp）很近的50bp序列的敲除成功率是100%，比array靶向范围稍远的500bp序列的敲出成功率大约是87.5%，1000bp序列的成功敲除率也大概是87.5%，3000多bp时候（整个mexB基因）敲除率就大概只有62.5%了。

3.利用CRISPR 系统对耐药性机理探究

构建了ΔmexB、ΔmexF和ΔmexH突变体（对应参与编码下面三个外排泵的组分），并检测了三个外排泵MexAB-OprM、MexEF-OprN和MexGHI-OpmD对PA154197耐药性的贡献——转录组分析表明这些基因过表达。

ΔmexB和ΔmexF都引起了一些种类的抗生素的MIC（最小抑菌浓度）下移，ΔmexH没有明显带来的MIC改变。作者进一步对ΔmexB和ΔmexF进行了组合敲除，比较其敲除单基因的MIC上的变化，最后得出结论：MexAB-OprM和MexEF-OprN同时过表达构成PA154197的主要耐药决定因素。

（本文剩下的内容对耐药性机制进行进一步的详细研究，主要研究方法和“3”类似，就是用CRISPR机制敲除某一些基因，然后研究单基因对耐药性的影响或多基因之间的关系，这里不再赘述）