文献标题：
Evaluating and mitigating clinical samples matrix effects on TX-TL cell-free performa-nce
DOI号：
https://doi.org/10.1101/2022.05.02.489947
关键词:
合成生物学;颗粒;生物传感器;诊断;临床样本
摘要：
无细胞生物传感器是一种很有前途的医学诊断工具，但其性能可能会受到来自样本本身或外部组件的基质效应的影响。本文使用两个报告系统，sfGFP和荧光素酶，系统地评估了血清、血浆、尿液和唾液中无细胞系统的性能。在所有情况下，临床样本都有很强的抑制作用。在不同的抑制剂中，只有RNase抑制剂能缓解基质效应。然而，他们发现RNase抑制剂的恢复潜力被商业缓冲液中甘油的干扰部分减弱。他们设计了一种无需额外步骤就能产生RNase抑制剂蛋白的菌株，从而解决了这个问题。此外，他们的新提取物产生了比以前条件更高的报告水平，并缓和了与基质效应相关的患者间可变性。这种统一于多种临床样本的无细胞系统鲁棒性的系统评估和改进，是向开发适用于多种疾病的无细胞诊断技术迈出的重要一步。
引入：
生物传感器是一种检测工具，它集成了来自传感器模块的生物识别元素，并将信号转换为快速、可测量的响应。快速护理点检测应用是临床环境中复杂技术程序的替代方案，减少了耗时和依赖设备的样品处理需求。因此，便携式生物传感器可以对慢性疾病进行密切监测，例如，便携式葡萄糖监测设备彻底改变了糖尿病治疗。这些工具适用于对此类临床人群的实时评估，并更精确地确定临床结果。这样，在考虑到患者自身环境和可变性的情况下，可以在临床环境之外简单、重复地取样，从而减少偏倚数据。此外，在资源匮乏的环境中，生物传感器是特别有前途的现场诊断工具，特别是在艾滋病毒、疟疾或寨卡病毒等传染性传染病和地方病的情况下。许多国家对COVID-19的检测反应不佳，这凸显了在全球范围内快速、低成本和易于分发的诊断设备的重要性。
无细胞表达系统作为多功能生物传感器工程的有前途的候选者的优势：
1、支持复杂的基因电路的操作。
2、需要较小的反应量。
3、与全细胞生物传感器相比，无细胞系统可以检测核酸等不能跨细胞膜的分子，以及对活细胞有毒性的分子。
4、除了非生物和非复制，几乎不需要生物遏制措施，细胞无表达系统不承受进化压力，可以改变全细胞生物传感器。
5、反应可以在环境温度或体温下发生。例如，通过将传感器贴在皮肤上，消除了在检测点使用孵化器等设备。
6、性能很容易通过不同的提取物和质粒组成来调整，并且蛋白表达产量可以通过多种方法进行优化。
7、无细胞生物传感器可以冻干并在室温下保持稳定长达一年，而且可以在不到一小时内提供快速反应。
8、工程细胞自由转录和翻译(TX-TL)系统与电化学平台的结合进一步实现了多种生物标志物的检测。
总之，无细胞系统具有反应时间短、储存时间长、与纳米电极界面兼容等优点，是临床和偏远地区进行病理生物标志物即时检测的理想选择。分散的便携式诊断技术的出现可能会改善全球流行病学数据的获取，事实证明，这些数据对于制定全球卫生保健措施以减轻非传染性疾病和近期疫情(如寨卡或COVID-19大流行)的影响至关重要。目前，一些问题限制了无细胞诊断平台的临床应用，如非识别标志物的交叉检测，或最重要的是，来自生物样本的干扰。复杂样品成分的可变性甚至会影响精密分析仪器的读数，这种现象被称为基质效应，可能会产生不准确的结果。这些效应在大肠杆菌提取物中产生的几种生物传感器中都有报道，这些生物传感器已经用人类样本进行了测试(表1)。
表1
尽管无细胞生物传感器的最终目标是它们的现场部署和病原生物标志物的即时检测，但只有很少的研究系统地评估了无细胞生物传感器在多种不同类型的人体生物样本中的性能。在这里，他们通过微创方法监测了四种类型的临床样本中大肠杆菌TX-TL无细胞提取物的性能，这些样本取自医院环境中的患者。样本在检测前未进行处理，除非在其基础准备阶段(即在适当的真空管中收集后进行血清和血浆的血液离心)。他们测试了样品对本构制备的超级折叠绿色荧光蛋白(sfGFP)和萤火虫荧光素的基质效应。
此外，他们系统地研究了添加RNase和蛋白酶抑制剂对大肠杆菌TX-TL无细胞系统的改善。重要的是，他们发现商业RNase抑制剂中的甘油会减少游离细胞的产生。因此，他们开发了一种大肠杆菌菌株，它可以在提取液生产过程中不需要任何额外的步骤就能在原位生产自己的RNase抑制剂，同时消除了商业抑制剂的成本，并增加了临床样品中比使用时获得的蛋白质产量。最后，他们通过检测10个血清、血浆和尿液样本来检验患者间的变异效应。
他们的新提取物降低了患者间的差异，尤其是血浆样本。通过探索不同类型临床样本的集合和个体患者样本的影响，并提供一种更简单的方法来减轻其基质影响，他们的结果代表着在开发针对一系列生物标志物和病理条件的无细胞诊断方面迈出了重要的一步。
结果：
在无细胞生物传感器中，临床样本基质强烈抑制报告基因的产生。
他们首先测量了各种临床样本(血清、血浆、尿液和唾液)对细胞游离活性的基质效应。为此，他们监测了在临床样本存在或不存在的情况下，superfolder GFP (sfGFP)和萤火虫荧光素酶(Luc)这两种组成型表达报告基因的产生。他们选择sfGFP和荧光素酶是因为它们都是广泛用于信号量化的常见报告因子。将组成型表达sfGFP或荧光素酶的质粒与大肠杆菌TX-TL提取物混合，该提取物是如前所述使用法国印刷机制备的，以及包含转录和翻译所需的构建块、盐和能量源的优化缓冲液。最后，由于这些核心反应组分占可用反应体积的80-90%，将未加工的临床样品以最终反应体积的10%加入反应混合物(图1A)。
他们量化了在没有或存在RNase抑制剂和两种蛋白酶抑制剂(细菌和哺乳动物)的情况下，不同临床样本对组成性报告基因表达的基质效应，相对于没有临床样本或抑制剂的阳性对照(图1B-C)。他们发现尽管程度不同，所有临床样本对报告基因的产生都有抑制作用。在没有任何抑制剂的情况下，血清和血浆几乎完全阻碍报告基因的产生(在没有样品添加的情况下，>98%的抑制)。在没有添加样品的情况下，尿液抑制了sfGFP和Luc报告基因产生的90%以上，而唾液对这两种报告基因产生的干扰最小(相对于对照组，对荧光素酶抑制70%，对sfGFP抑制40%)。
图1
图1注：
有害的临床样本基质对报告基因表达的影响被商业RNase抑制剂部分恢复。A.将编码sfGFP和荧光素酶蛋白的质粒与大肠杆菌细胞提取物、优化的反应缓冲液和临床样本(血清、血浆、尿液或唾液)混合。c。矩阵效应的量化。将100 nM组成型表达sfGFP (B)或荧光素酶(C)质粒加入到含或不含10%临床样本的无细胞系统中，包括小鼠RNase抑制剂(mRI)、细菌蛋白酶抑制剂(pI)或哺乳动物蛋白酶抑制剂(mPI)。相对于阳性对照(无临床样本或抑制剂)，所有测量均归一化。每个临床样本是来自三个不同个体的一个池。数据是在三个不同的日子里进行的三个实验的平均值。误差条对应±SD。
商业RNAse抑制剂可部分恢复细胞的游离活性，而蛋白酶抑制剂对基质效应的缓解效果较差
他们测试了两类抑制酶活性的添加剂:RNAse和蛋白酶。RNAse抑制剂以前在某些类型的临床样本中被证明可以提高细胞游离反应的效率，或者用生物液体系统地添加到细胞游离反应中。此外，来自大肠杆菌提取物的内源性蛋白酶也被认为会影响蛋白质合成的产量。他们选择测试细菌和哺乳动物的蛋白酶抑制剂，以解释在大肠杆菌提取物和人类临床样本中发现的蛋白酶。
添加RNase抑制剂后，尿液中sfGFP的产量提高了约70%，血清中提高了20%，血浆中提高了40%，而在任何临床样本中，细菌和哺乳动物蛋白酶抑制剂都未能提高细胞自由反应性能(图1B)。当使用萤火虫荧光素酶报告时，结果在所有条件下都是可比性的。添加RNase抑制剂可以恢复唾液、血浆、血清以及尿液中的荧光素酶信号，在没有临床样本的情况下，荧光素酶的产量达到50%(图1C)。与sfGFP一样，细菌和哺乳动物蛋白酶抑制剂并没有对细胞游离蛋白合成产生显著的改善。
甘油存在于酶抑制剂的商业缓冲液中，在无细胞反应中负责信号降解
虽然RNAse抑制剂在临床样本存在时通常导致蛋白产量增加，但在所有情况下，完全信号(即没有临床样本存在时)从未恢复。此外，他们在没有任何临床样本的情况下测试了抑制剂在无细胞反应中的作用(补充图1)，并观察到所有抑制剂都降解了报告基因的产生，其中RNase抑制剂是最有害的(与没有抑制剂相比，信号减少了约50%)。
他们想知道商业RNAse抑制剂的缓冲成分可能是导致这种现象的原因。首先，他们比较了加入和不加入RNase抑制剂与制造商列出的相同成分的缓冲液(50 mM KCl, 20 mM HEPES, 8 mM DTT, 50%甘油)的无细胞反应效率(图2A)。确实，添加RNase抑制剂的蛋白质产量明显下降，这与单独添加缓冲液是相同的。在一系列质粒浓度范围内，这一结果是一致的(补充图2)。为了弄清楚缓冲液的哪一部分是负责的，他们分别将商业缓冲液的每一种成分分别加入到无细胞反应中，包括单独和所有可能的组合(图2B)。他们发现，在所有情况下，单独的甘油(在1%的最终反应浓度下)占sfGFP产量下降的原因，而与缓冲液中任何其他成分的存在无关。这些数据表明，添加RNase抑制剂时观察到的游离细胞反应性能的下降完全是由于缓冲溶液中含有甘油。
原位生产RNase抑制剂可以提供与商业抑制剂相同的保护，同时可以产生更高的报告基因
然后他们假设，他们可以通过在大肠杆菌中表达RNase抑制剂来避免甘油抑制，同时培养无细胞提取物。这将防止甘油的需要，并有降低总反应成本的额外好处。他们将经过密码子优化的小鼠RNase抑制剂(mRI)基因克隆到T7启动子下的质粒中，然后将其转化到感受态大肠杆菌中进行提取。由于在生长过程中添加IPTG是原位产生T7 RNA聚合酶的一种常见的无细胞操作，因此将mRI基因置于T7启动子下将允许高mRI生成，并且可能在此过程中不需要额外步骤(图2C)。
图2
图2注：
mRI掺杂提取物产生更大的蛋白，并调节患者间基质效应。A.临床样本(血清、血浆、尿液)与缓冲液、10 nM sfGFP DNA和三种大肠埃菌提取条件之一混合:标准提取液、商业mRI标准提取液或现场生产mRI掺杂提取液。B.每个样品的基质效应的量化。荧光强度归一化为等效浓度的FITC (nM)。C.与商业mRI标准提取物相比，mRI掺杂的sGFP产量的Fold change。每个临床样本是三个不同个体的池。数据是在两个不同的日子里进行的两个实验的平均值。误差条对应±SD。D.每个临床样本的个别患者sGFP生产情况。10名患者的样本在3个不同的天内独立进行测量。彩色实点和细灰线表示每个患者的平均值和标准差。实蓝线表示种群的平均值和标准差。
大多数检查无细胞生物传感器开发和优化的研究使用混合临床样本或临床样本的人工等价物。他们认为，他们的系统没有直接测量任何生物标志物的存在，代表了研究患者之间基质变异的最佳基准机会。此外，他们希望测试mRI原位生成是否能进一步减轻患者间基质效应。他们连续三天检查了10个不同患者的血清、血浆和尿液样本，确保了商业抑制剂或mRI掺杂提取物的测量之间的独立性(图3D)。在所有情况下，当使用掺杂mRI提取液时，数据的分散度都较低，尤其是血浆和尿液。这些结果突出表明，尽管使用RNase抑制剂可以改善蛋白质生产，但开发具有足够鲁棒性的无细胞诊断方法可能仍面临重大挑战，以适应在护理点环境中患者样本和采样条件之间的差异。
讨论：
他们的工作流程提供了关于TX-TL无细胞生物传感器在各种临床人体样本中的性能的统一数据和系统研究。他们研究和比较了复杂介质中的基质效应，并评估了简单和可重复的优化策略。他们进一步研究了可能对传感器性能有有益影响的抑制剂的扩展范围，包括哺乳动物和蛋白酶抑制剂。对人类生物样本的干扰和可能的优化策略的了解对于将无细胞生物传感器应用于具有广泛病理条件的真实临床人群非常重要。这一步骤对于实现其作为下一代快速、低成本现场诊断平台的潜力至关重要。他们的程序简单、可重复，并可用于实际的临床环境，以大规模验证TX-TL无细胞生物传感器的使用。
他们的工作流程的优点之一是没有样品预处理，这需要大量的技术方法，如分析物提取或蛋白质相分离。唯一的样品处理是标准的离心程序，用于从全血管中获得血清和血浆。他们的数据支持将无细胞生物传感器扩展到偏远环境下的各种新鲜人体样本，而不需要复杂的技术样本处理。在需要血浆或血清的化验中，这些生物传感器可以与低技术含量的离心机(如造纸离心机或打蛋离心机)结合，用于样品制备。
他们比较了两个著名的报告模块，sfGFP和荧光素酶，在各种临床样本中的信号输出。尽管唾液的抑制作用最小，但在所有病例中，临床样本的添加都强烈地抑制了报告信号。血清和血浆中添加RNAase抑制剂后，性能显著下降和部分恢复可能与动脉、静脉和毛细血管内皮细胞分泌大量胰腺型核糖核酸有关。
类似地，人类的尿液长期以来被认为含有多种RNase活性。有趣的是，虽然人类唾液可以表现出核糖核酸酶活性，特别是在某些病理条件下，但他们的结果表明，它本身并不总是对样本基质效应有显著贡献。sfGFP作为即时诊断报告的一个潜在缺点是需要生产低成本的设备，可以激发荧光蛋白并过滤发射信号;然而，其他研究小组已经在设计3D打印荧光阅读器，这种阅读器可以很好地实现这一目的。与sfGFP的使用相比，在临床环境中使用荧光素酶的缺点是需要添加荧光素酶底物(荧光素)来触发发光。然而，与荧光素相关的传感器具有为不需要外部光源刺激的简单光学装置提供可检测信号的优势。一些研究报道了用智能手机摄像头进行简单的信号检测，可以很容易地在病人床边处理。此外，其他诱导颜色变化的记者，如LacZ或C23DO，可以提供一个简单的，可视的输出结果。（这里是不是可以在读取部分简化硬件？）
RNAse抑制剂的某些特定作用可能被减弱，损害了信号的完全恢复。他们发现RNase抑制剂商业缓冲液中含有的甘油是导致细胞游离反应效率降低的原因。虽然甘油抑制无细胞反应的证据以前已经报道过，但目前缺乏无甘油RNase抑制剂排除了另一种可行的商业选择。他们决定通过设计一个可以在提取液制备过程中产生原位mRI的大肠杆菌质粒来避开甘油效应。他们发现，在细胞生长阶段，通过在T7启动子的控制下产生mRI，他们创造了一种细胞提取物，可以保护细胞免受RNaseA和商业RNase抑制剂的影响，而不需要缓冲甘油的整体信号降低效应。此外，由于不含甘油，该提取物在临床样本中表现出更高的信号。虽然最近的出版物也有类似的方法生产mRI来帮助防止临床基质效应，但它们需要多重反应，或在不同温度下生长的多重提取物与额外的折叠伴侣物的组合。相比之下，他们的菌株不需要任何额外的步骤，除了在细胞生长过程中添加IPTG，这已经是在无细胞提取物中诱导T7聚合酶产生的常见做法。
最后，他们使用一种商业抑制剂和他们的掺杂mRI提取物检查了三种不同临床样本(血清、血浆和尿液)的患者间可变性。通过使用每一种物质的10个个体样本，他们发现，当使用掺杂提取物时，基质效应在患者之间产生的变异性较小，特别是对血浆和尿液。这种使用大量个体患者的验证，对于开发新的生物传感器至关重要，因为他们表明，基质效应可以如此显著，以至于在一个患者的尿液样本中完全消除蛋白质的产生。由于尿液中不同离子和代谢物的浓度会因患者的水合作用而有很大的差异，所以看到尿液中有很大的差异也许并不令人惊讶;然而，这些发现强调，在无细胞诊断能够可靠地用于即时护理环境之前，仍然需要对无细胞诊断进行显著的鲁棒性设计。有趣的是，血浆显示了最低的患者间变异性。血浆和血清可以经常互换使用，获得血清的凝血过程会导致某些血小板成分的变化，如天冬氨酸转氨酶、乳酸脱氢酶、纤维蛋白/纤维蛋白原和血清素。进一步的研究可能会研究哪些成分会特别影响游离细胞的表达，但他们的工作表明，血浆可能是一个很好的临床样本，因为在慢性疾病或长期随访研究或诊断中，需要高度的重现性。
总的来说，这些结果代表了使用无细胞系统对未经处理的样品进行临床诊断的一些希望和潜在挑战的全面概述。除了提供一个数据集，在一组统一的实验中比较四种常用的临床样本，据他们所知，它代表了血浆第一次被用于无细胞反应。此外，唾液特别有趣，因为它涉及一种无痛、非侵入性的收集过程，可以潜在地用于监测神经退行性疾病和神经精神疾病的进展，如自闭症、阿尔茨海默氏症、帕金森氏症和亨廷顿氏病，以及口腔微生物群。与牙齿和牙周健康有关。向更广泛的临床样本开放无细胞生物传感器，并通过系统优化确保其可靠性，将有助于提供便携、低成本的诊断工具，以应对全球卫生挑战。
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