IGEM竞赛文献分享 PNAS: Cas1–2/3复合物的结构及调节作用

文献标题：

Cas1 and the Csy complex are opposing regulators of Cas2/3 nuclease activity

DOI号：

https://doi.org/10.1073/pnas.1616395114

关键词：

Cas2/3，Cas1，CRISPR I-F

1.背景

CRISPR有6种型（type I-VI），19种亚型。Type I是最常见的一种类型，有7种亚型（subtype I-A to I-F，and I-U），这7中亚型都依赖于Cascade来对外源DNA检测并且都依赖于Cas3来降解靶向的DNA。Cas3：

N端是HD（histone-aspartate）核酸酶结构域，C端是superfamily II（SF2）解旋酶结构域。

2.Cas1-2/3

Cas1和Cas2对于识别和把新的spacer整合到CRISPR-array上是必需的，近期的研究表明，Cas3也参与adaption的过程。在大肠杆菌(I-E型)中， 4个Cas1分子和2个Cas2分子组装成一个复合物。但I-F与其他I型系统不同的是，Cas2和Cas3是融合的，也可以说， Cas2和Cas3的融合是I-F的独特特征(P.S.有的文献用Cas2/3表示Cas2和Cas3的融合，有的文献用Cas2-3来表示Cas2和Cas3的融合，这里统一用Cas2/3来表示)。

接下来就简要介绍一下融合的Cas2/3结构和Cas2/3：

（1）Cas2和Cas3在gene层面融合：

I-F型Cas2和Cas3在gene层面就是融合在一起的，表达出来是一个单一的融合的多肽。Cas2/3中，Cas2在Cas3的N端，和Cas3的HD 核酸酶结构域相连；CTD是指Cas3的C端结构域，具有解旋功能；Rec是解旋酶结构域。

（2）Cas1-2/3三级结构：Cas14:Cas2/32

研究发现，4个Cas1和2个Cas2/3会组合在一起起作用，简写为Cas14:Cas2/32。结构图见下D、E、F图：

简单来说就是，两个Cas2/3分子与四个Cas1分子组装成一个四叶螺旋桨状结构，其中两个Cas2结构域（Cas2 dimer）形成一个中心枢纽（两个对称轴），两侧有两个Cas1叶和两个Cas3叶。比较重要、需要说明结构特征还有以下两点：

（1）Cas1和 Cas3的CTD区域结合。这可能和Cas1对Cas2/3功能的调控相关；

（2）Cas2/3融合蛋白的Cas2结构域与Cas3解旋酶的RecA1结构域相互作用，而Cas3的CTD在Cas1的螺旋结构域上补充了形状和电荷。CTD与DNA结合和靶标降解有关，这种相互作用进一步表明Cas1可能影响Cas3的功能。

3. Cas2/3的性能和其活性的调控

为了验证Cas2/3的性能和调控它的东西，分别纯化了Cas2/3，Cas1，Cascade、AcrF等蛋白，检验Cas2/3在各种条件下体外降解模拟了R-loop的DNA（就是在dsDNA中做出一个bubble来模拟R-loop、做出ssDNA的状态）。具体如下图：

图解：

A-G都是体系中加入不同的蛋白的降解结果，具体加的是哪些蛋白看H图的注释，那个百分比值指的是DNA降解程度；H图中，横轴表示体系中加的蛋白，纵轴表示DNA被降解成碎片的比例（破碎程度）。Csy指的就是Cascade，apoCsy就是带的crRNA不能和体系中的R-loop配对的Cascade，AcrF指的就是anti-CRISPR系统表达出的能和Cas2/3结合、阻止Cascade招募Cas2/3的蛋白。

结果表明：

（1）单独的Cas2/3可以对ssDNA进行降解

（2）Cas1抑制Cas2/3的核酸酶活性

之前提到了，Cas1能和 Cas3的CTD区域结合。Cas1将CTD稳定在一个封闭的构象中，从而限制DNA进入HD活性位点，从而起到抑制Cas2/3活性的作用。但Cas1对Cas2/3的结合并不影响Cascade对Cas2/3的招募作用

（3）Cascade激活Cas2/3的核酸酶活性，激活之后，Cas2/3结合到游离的ssDNA上，按3’-5’的方向降解

（4）AcrF并不直接抑制Cas2/3的核酸酶活性，而是通过抑制Cascade对Cas2/3的招募作用来抑制CRISPR进行interference的能力

同时，研究者发现，在没有加Cascade的组，由于没有指引，Cas2/3无法精准定位到DNA的具体位置上，对ssDNA区域的剪切是断断续续的；加了Cascade的组则会对R-loop从头到尾的精准剪切破碎。

4.Cascade招募Cas2/3

就是说在interference中起作用的是Cas2/3，所以在interference时，Cas1会从Cas1:Cas2/3上脱离下来；但Cas1-Cas2/3仍旧是具有剪切活性的。

5.Cas2/3能剪切dsDNA——和I-F的bidirectional spacer acquisition功能适配

在interference过程中，Cas2/3会对两条链都进行剪切，但对游离出来的那条ssDNA的剪切效率（文章的数据是85%）要比另一条和Cascade结合的（文章的数据是20%）高很多。