课题：2021XMU-China
主要内容：核电站冷却系统中生物污损问题的防治
关键词：贻贝、粽囊藻、生物污损
一、背景介绍
核电作为一种清洁能源，如今正在稳步发展之中，而海水作为核电站的热交换介质发挥着重要作用，但海水在涌入核电站的同时，其携带着的各种藻类(粽囊藻等)和贻贝等海洋生物也往往会附着在核电站的进水口、进水管等区域，造成冷却系统的堵塞，每年需要花费大量的精力和资金进行清理。目前，人们主要采用化学消毒的方法对污损进行处理，但可能对环境造成破坏。研究者们主要利用合成生物学的方法，解决球形粽囊藻和贻贝等海洋生物对核电站冷却系统的生物污损问题。
二、实验设计
首先，研究者们选用需钠弧菌作为研究者们的底盘生物，需钠弧菌中的基因编辑和异源表达的方法已经相对成熟，且在海水的高渗环境下，需钠弧菌也可进行快速的生长和繁殖。
1.解决粽囊藻繁殖问题
首先，针对球形粽囊藻。球形粽囊藻是引起赤潮的主要藻类。其一旦聚集形成种群，会形成一层保护膜，会大大增强粽囊藻的抵抗力，从而使得去除更为困难。针对这一问题，首先，研究者们将组氨酸氨解酶 HutH 释放到球藻周围的微环境中，将保护膜粘液中的L-组氨酸转化为反式尿酸盐，从而提高粽囊藻细胞中的活性氧(ROS)破坏藻类细胞。
此外，为了进一步提高精确度，研究者们以细胞表面的纤维素为靶点，通过耦合HutH与纤维素结合蛋白(CBM)，提高HutH对粽囊藻细胞的靶向性和杀伤力。作用原理示意图如图所示。
图1：HutH 与 CBM 嵌合蛋白靶向藻类细胞表面，杀伤藻类细胞
为了使研究者们的设计的更加全面，研究者们还需解决藻类细胞形成种群的问题，研究者们使用了SpyTag/SpyCatcher体系以及半乳糖结合蛋白 LecA来识别并捕获种群中藻类细胞分泌的囊泡，最终下沉到水环境底部，从而抑制粽囊藻种群的扩大。其作用机理示意图如图2所示。
图2：LecA 识别球藻表面的半乳糖并利用 SpyTag/SpyCatcher 体系聚集沉降
2.解决贻贝的粘附问题
接着，针对贻贝的粘附问题，通过其作用机理的调研，研究者们发现，贻贝可牢牢粘附在固体表面并分泌贻贝粘附蛋白(Mfp)，Mfp侧链中含有大量的DOPA(多巴)，可与金属表面形成氢键，促进贻贝与固体表面的相互作用。其次，贻贝的足丝还可释放脂肪酸，为Mfp的作用提供疏水环境，进一步促进贻贝的粘附作用。因此，针对作用机理，研究者们设计的工程菌必须抑制贻贝足丝的形成，去除脂肪酸，消除 DOPA 的作用。
首先，针对DOPA与金属表面形成氢键的问题，研究者们利用多酚氧化酶(PPO)的释放，将 DOPA转化为多巴醌，即将两分子的DOPA通过羟基形成的氢键相连，从而阻止DOPA与冷却系统中的金属表面形成氢键。其次，研究者们利用了TnaA-his功能酶，将合成足丝所需的色氨酸转化为吲哚，进而抑制足丝的形成。最后，研究者们利用铜绿假单胞杆菌所产生的RhlA和RhlB两种生物洗涤剂来去除足丝释放的脂肪酸，具体的效应机制如图3所示。
图3：足丝的粘附和RhlA/RhlB，PPO的效应机制
3.信号肽和表面修饰系统
首先，为了确保需钠弧菌表达的目的蛋白的释放，研究者们设计了两种信号肽--Aly01/LMT(信号肽LMT由研究者们自主设计)，帮助将目的蛋白转运到细胞外环境中。如图4所示。
图4：信号肽 Aly01/LMT 帮助运送目的蛋白到细胞外环境中
接着，对于表面展示系统，研究者们选择了以下三种蛋白：LCI KR-2、OmpA和LamB。其中，LCI KR-2是一种来源于枯草芽胞杆菌的多肽突变体，具有很强的聚丙烯吸附能力，而OmpA和 LamB两种蛋白作为锚定蛋白，提供细胞表面展示的支架，可将LCI KR-2锚定到需钠弧菌表面。因此，研究者们只需在冷却系统的格栅上涂上聚丙烯，表面展示LCI KR-2的需钠弧菌就可牢牢吸附在格栅表面，分泌PPO等功能酶，抑制贻贝的粘附作用。表面展示的作用机理如图5所示。
图5：表面展示有 LCI KR2 的需钠弧菌可牢牢吸附在涂有聚丙烯的格栅上
4.自杀系统的设计
由于核电站的冷却系统直接与海洋相连，可能存在工程菌泄露的危险，因此，研究者们设计了一个基于光遗传系统的生物反应终止开关，避免工程菌逸散到生态系统中。研究者们在冷却系统的出水口铺设了蓝光光源，当工程菌在黑暗的水环境中时，可正常工作，而当工程菌进入出水口时，研究者们启用蓝光诱导的启动子，激活自杀开关，使得工程菌在进入自然环境之前死亡。
研究者们选择了基于细菌转录因子EL222的光遗传回路。该回路具有诱导条件简单，响应时间快、对蓝光强度高度敏感等优点，EL222是一种蓝光激活的DNA结合蛋白，具有光敏结构域LOV和HTH(helix-turn-helix)结构域。当蓝光照射时LOV结构域被激活并引发光化学反应，使得EL222分子二聚化，二聚化的EL222分子可激活启动子pBlind，促进下游基因的转录。为了加强正反馈调节，研究者们设计了pBLind-EL222-pBLind-blrA蓝光诱导系统，使得pBLind在被激活后可进一步促进EL222的表达。
BlrA作为下游的毒力蛋白，是一种蓝光诱导的 GTP受体，同时也是一种来源于枯草芽孢杆菌的黄素结合荧光蛋白。在正常情况下，BlrA对细胞没有毒性，而当暴露在蓝光下时，BlrA作为光敏剂，可产生大量的活性氧(ROS)，从而杀死细胞。蓝光密度必须大于90mW/cm2，治疗时间应大于10秒，才能达到相对较高的死亡率。其具体作用机理如图6所示。
图6：BlrA 蛋白的激活和表达机制
三、实验过程
由于研究者们的项目与贻贝相关，我重点阅读了解决贻贝部分的实验过程。首先，研究者们设计了基因回路(图7)并将重组质粒转化到大肠杆菌 DH5α中，经过菌落PCR验证后进行培养扩增，然后再利用电穿孔的方法导入需钠弧菌中，利用菌落PCR和DNA测序判断是否导入成功。
后续研究者们再利用特定时间内由色氨酸转化为吲哚的含量判断tnaA酶的活性接着，研究者们再验证了PPO的表达，研究者们使用T7启动子进行诱导，经过SDS-PAGE验证后发现PPO在大肠杆菌和需钠弧菌中均可成功表达。后续再测量多巴醌的吸光度，计算酶活性。
总的来说，研究者们们利用以大肠杆菌DH5α为中间载体，现将重组质粒导入到大肠杆菌中，验证其可成功表达后再导入到需钠弧菌中进行验证。
图7：tnaA-his 基因回路
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