2021 NUS_Singapore iGEM课题分享

iGEM课题分享

2021 NUS_Singapore

Photo-Regulated Yeast for Synbio Manufacturing

Background

新加坡面积小，人口密度高，需要提高粮食产量，增加粮食自给率。因此，选择垂直种植的方法来提高单位面积的种植密度。但高密度的作物使病虫害更容易传播，导致产量的下降。

因此，该团队希望设计一种工程菌，用于生产人类β-防御素（HBD）作为生物杀虫剂，以解决危害垂直种植的病虫害问题。该团队利用光遗传学实现了工程菌的三种功能：红光诱导酵母生产和分泌人类β-防御素；蓝光诱导酵母X型絮凝；两种光激活自杀开关，杀死酵母。

Genes

EL222 蛋白是一种来自海滨芽孢赤杆菌的光敏转录因子，与 C120 启动子一起组成光遗传转录系统，能够通过蓝光控制目的基因的表达。暴露在蓝光下时，EL222 能够形成二聚体，与 C120 序列结合。

TALE 是由黄单胞菌分泌的天然Ⅲ型效应蛋白，具有DNA结合域（DBD）和激活域（AD）.其中心重复序列（CRD）包含了用于序列特异性DNA结合的保守的34个氨基酸重复序列，因此是一类可编程的DNA结合蛋白。

FLO1是参与絮凝的凝集素样蛋白。作为一种细胞壁蛋白，能够结合其他细胞表面的甘露糖链，赋予酵母形成絮凝物的能力。

Design

新加坡国立大学团队利用光诱导系统控制生物农药人类β-防御素与絮凝相关蛋白Flo1的合成以及诱导工程菌自杀。

首先，将启动子上游的活化序列取代为SynPALE靶向的DNA序列。PhyB与PIF3分别是光敏色素和为光敏色素相互作用因子，在红光存在的情况下，他们会相互靠近。因此，将TALE的DNA结合域与PhyB融合，激活域与PIF3融合，SynTALE-PhyB就会结合在启动子上游，当红光存在时，PIF3-AD就会与SynTALE-PhyB结合，激活域AD靠近启动子启动下游基因的转录。HY1 和 PcyA 蛋白参与生色团合成，为了使 PhyB 正常发挥功能，需要引入这两个基因。

同样地，将核定位信号融合的 EL222 蛋白与 VP16 活化结构域融合，得到融合蛋白。暴露在蓝光下时，以单体存在的 EL222 蛋白改变构象，暴露 LOV 结构域和 HTH（helix turn helix）结构域形成与靶 C120 序列结合的二聚体，激活域接近启动子而启动下游转录，产生 Flo1 蛋白，造成酵母絮凝。

a. 当蓝光不存在时，启动子 C120-CYCp 不会被激活产生 TetR，从而产生 LacI 抑制lacO，核酸内切酶不表达

b. 当红光不存在时，pAND 不被激活，核酸内切酶不表达

c. 只有当蓝光与红光都存在时，才会启动下游转录

Results

该团队原本计划采用乳铁蛋白作为生物农药，但在分泌的检测中，由于pGmLf-H 中未出现与阳性对照组相同的 80kDa 条带，说明乳铁蛋白未成功合成和分泌。由于时间的限制，该团队选择放弃乳铁蛋白，采用HBD2。

采用新加坡合成生物初创公司Vaciome捐赠的用于毕赤酵母的HBD2结构后，该团队成功地使用酿酒酵母合成了HBD2。

使用mKO荧光蛋白检测蓝光调控系统的代谢功能。在蓝光诱导下，实现了 mKO 的高表达。但在黑暗条件下，pC120-mKO-EL-U 仍然有大量表达，说明蓝光诱导系统具有严重的泄露表达。因此，该团队决定将基因定位于基因组中，以减少泄漏的情况。

运用 Gibson 同源重组将基因整合到基因组上，减少泄露表达，并减少 EL222 二聚化。实验证明了整合在基因组上的 EL222 基因能够正常表达，且泄露表达减少到 50%。100%蓝光和 50%蓝光下 mKO 表达差异不大，说明系统对蓝光敏感。

该团队计划通过增加启动子结合位点的方式增加启动子活性，但建模表明这种方式可能会增加泄露。因此，他们设计了双重抑制的系统来解决这一问题。但实验结果并不理想，在蓝光诱导下的抑制现象并不明显，需要进一步排查故障。

通过前馈系统增加蓝光诱导系统对蓝光的应答。实验结果证明表达量增加到两倍而泄露量则没有相应增加，pRL3CM-H 仍然表现出一定程度的泄露。

具有核酸内切酶功能的BBa_K1159105被选为理想的杀伤开关，因为它不仅可以防止活生物体逃离生物反应器，还可以破坏修饰的DNA，减少水平基因转移的机会。

为了提高核酸酶的功效，在该part的N末端添加了NLS序列，这有助于定位到细胞核以消化基因组和DNA，增加细胞培养物的死亡率。实验结果证明死亡率增加。

由于时间不足，未完成红光转录因子的工程。

Model

对诱导蓝光系统进行建模，以揭示其机理动力学特征。

利用拟合曲线来建议和探索蓝光激活表达系统的可能改进。

建立了一个两全其美的新絮凝模型：该模型不仅计算成本低廉，而且仅使用分光光度计即可通过OD测量进行验证。

通过结合两个常微分方程系统完成建模。

Human Practices

综合人类实践

1. 了解当地的害虫问题

2. 定义一个好的解决方案

3. 构思我们的解决方案

4. 实施和评估

受白粉病影响的草莓

教育与交流

与南洋理工大学（NTU）iGEM合作组织了的面向大学预科学生的研讨会，介绍合成生物学基础知识和一些著名的行业应用

制作了一个消费者教育视频，以传播对生物农药的认识