课题：2020NUS_Singapore
主要内容：
为细胞设计启动开关，从而能够控制其生产力并延长其生产寿命。
关键词：
毒素-抗毒素系统；生长控制；营养代谢；生物遏制
一、概述
研究发现部分大肠杆菌在长期使用的未更新培养基中仍然能够存活，该课题假设营养负荷是导致细胞死亡的根本原因，通过操纵细胞的代谢状态来减缓不必要的营养消耗或保存细胞资源的方法是延长细胞寿命的关键。于是，利用毒素抗毒素和葡萄糖抑制系统创建了一个“开关”和一个可调“旋钮”，为合成生物学提供了一种严格控制细胞生长的方法。
二、生长控制系统
1.毒素-抗毒素系统
HicA-HicB：大肠杆菌内源表达。HicA毒素可以与mRNA中的特定序列结合并降解它们，从而降低蛋白质的翻译率，全细胞翻译的减少将导致增长总体下降。HicB抗毒素通过与HicA毒素结合来中和HicA毒素的作用。在正常的细胞条件下，与HicA毒素相比，HicB抗毒素的含量更高，因此可以生长。在压力情况下，HicB抗毒素的降解速度比HicA毒素快，因为它的结构不太稳定，导致生长停止。随后的HicB表达已被证明可以诱导生长恢复，这表明HicA-HicB系统本质上是抑菌的。
图1：HicA-HicB在正常和应力状态下的作用机制
RES-Xre：大肠杆菌外源表达。RES毒素作为NAD酶会降低NAD+的胞内水平，从而阻止生长。随后，在Xre中和RES后，NAD+可能会被上调（由于蛋白质复合物中存在Helix-Turn-Helix DNA结合结构域，抗毒素同样参与其自身的基因调节）——导致累积资源（如葡萄糖、ATP等）的使用，从而产生和生长蛋白质。
图2：RES-Xre在正常和应力状态下的作用机制
2.葡萄糖吸收系统
除了考虑到毒素对下拨生长的抑制外，葡萄糖摄入量也可能限制细胞生长。在大肠杆菌中，葡萄糖的摄入由PtsG葡萄糖转运体调节。大肠杆菌通过两种机制调节PtsG的活性和表达。首先，细胞会产生一种被称为SgrS的小RNA直接与PtsG mRNA相互作用并导致其降解，导致PtsG蛋白浓度降低。此外，还发现SgrS RNA编码一种被称为SgrT的蛋白质，该蛋白质也与PtsG蛋白相互作用，抑制其功能。
图3：SgrS作用机制
三、模块化调控元件
使用化学诱导和蓝光诱导作为开关，在化学诱导中，使用乳糖和阿拉伯糖来控制毒素和抗毒素诱导，而由于阿拉伯糖和葡萄糖的混淆作用，选择Tet操纵子用来控制SgrS系统。在蓝光诱导中，该课题使用了蓝光EL222系统，该系统能够通过EL222 DNA结合蛋白的光活化二聚化来控制基因表达，以调节抗毒素的表达。蓝光系统的主要优点是它是可逆的，允许打开和关闭抗毒素的表达，并延伸到细胞生长。
图4：化学诱导双稳态开关
图5：蓝光诱导机制
四、细菌的质粒保留和生物遏制
目前使用抗生素作为选择压力使细胞保留质粒的方法有明显弊端，因为抗生素会随着时间的推移而降解，如果长期储存在室温下，大多数抗生素是无效的。此外，为了诱导抗生素耐药性，抗性基因必须转化入细胞，而水平基因转移将会导致抗性的种间传播。故而除使用抗生素之外用于让细菌保留质粒的方法是被需要的。
研究表明，与野生型相比，某些毒素-抗毒素对能够显著增加细胞中保留质粒的持续时间，本课题决定使用另一组毒素-抗毒素系统，与上述调节“开/关”开关的可控模块分开。在这个系统中，毒素-抗毒素对本身起到选择压力的作用。这样一来带有所需模块的质粒也会被选择性地保留在细胞中，并且双毒素-抗毒素系统能够起到生物遏制的作用。
图6：生物遏制系统
从上图可以看出，只有当两种质粒同时存在于细胞内时细胞才能够存活，因此，成功水平基因转移的几率大大降低。此外，该系统通过加倍作为保留质粒的一种方式，消除了对抗生素耐药性的需求，从而进一步降低释放到环境中的危险性。
对于这个保留和生物封闭模块中使用的毒素-毒素系统，使用了Txe-Axe和Hok-Sok毒素-抗毒素系统。两者都据称具有杀菌性质。还有研究发现这两个系统都能够提高插入该系统的质粒的保留率（假设在不同质粒上交换毒素和相应的抗毒素可能会产生更显著的保留和杀伤效果，故而该课题没有将与睡眠-唤醒模块相同的毒素系统用于这个遏制和保留系统，为了避免两者之间有任何可能的干扰，这将使描述它们的个体影响变得困难。）但是这个生物遏制系统只能防止遗传回路传播到外部环境。并不能防止菌本身的意外扩散，结合自杀回路则可以。
五、结果
1.turn off：IPTG诱导下HicA-HicB系统和RES-Xre系统显示出显著的增长，细胞生长被显著抑制。（但是由于细胞内可能存在反馈系统以应对NAD+水平的下降，故在诱导后10小时出现了细胞生长）
2.turn on：在诱导毒素表达两个半小时后诱导了抗毒素基因的表达，抗毒素表达诱导的生长停止细胞显示出生长的恢复。并且通过测定抗毒素表达前后的CFU，结果表明即使在生长停止10天后，生长截断的细胞仍然能够保持活力，在诱导抗毒素表达后保持生长和分裂的能力，证明毒素是在不杀死细胞的情况下触发生长停滞。
图7：【Turn off】
图8：【Turn on】
3.诱导前后蛋白表达情况对比
图9：（a）HicA毒素表达在1小时时诱导的生长停止生长细胞的生长曲线显示（b）总GFP和（c）平均GFP生产率下降，表明细胞生长的抑制抑制了其蛋白质的产生速度。（d）与正常生长的对照细胞相比，HicA介导的生长停止细胞的蛋白质生产水平（最大-初始）明显较低。
4.优化蓝光可控系统作为生长开关的替代输入
图10：将该蓝光抑制启动子放在HicB基因前，HicA基因仍在IPTG诱导启动子的控制之下。蓝光的存在会导致HicB生成减少，则菌生长抑制。
图11：【Turn off】
图12：【Turn on】
图13：当生长停止的细胞保持在黑暗中并测量12小时时，蓝光控制生长开关对（a）细胞生长（b）总蛋白质产量和（c）平均蛋白质产量的影响。
六、个人评价
总结一下就是，双毒素-抗毒素系统防止HGT并代替抗生素保留质粒、毒素-抗毒素+葡萄糖吸收系统生长控制。我们正在纠结调控两种菌的机制该怎么设计，而且抗生素本身的使用也是很大的问题，根据这个课题，或许可以想出一些其他的方法。
【竞赛报名/项目咨询请加微信：mollywei007】
