PRYSM-新加坡国立大学2021年iGEM项目课题分享

XMU-iGEM 2024课题分享

1、课题标题

PRYSM——2021年NUS_Singapor

2、课题背景

新加坡国土面积小导致耕种和农用面积极小，存在着严重的粮食问题，农产品依赖大量进口。相比于水平种植，垂直种植在同等面积上的生产量为 20 倍。COVID-19 扰乱了全球食品供应链，暴露了新加坡食品供应链的脆弱性，其中 98%的食品是进口的。随着新加坡努力实现到 2030 年本国生产 30%食品消费的国家目标，不断增加的农场对适当害虫防治的需求将会激增。合成农药仍然被认为是害虫防治的黄金标准。

然而，对合成农药对环境/健康的负面影响的担忧限制了它们的使用。生物抗菌肽已被确定为潜在的替代品，但利用现有的生物生产方法，生产用作生物农药的此类化合物在经济上是不可行的。该项目旨在使用更具成本效益的方法生产人类β防御素，在农场用作生物杀菌剂/杀真菌剂，通过开发光遗传学控制的酵母底盘和专为该底盘设计的开源生物反应器来实现。

课题原理

团队设计的 PRYSM 生物制造系统利用光遗传学将硬件和生物系统连接起来，以精确控制工程酿酒酵母的3个关键功能：红光诱导酵母产生和分泌生物农药：人类β防御素；蓝光诱导酵母絮凝，使它们聚集和沉淀，以便于提取肽；同时使用红光和蓝光可激活基于核酸酶的终止开关，实现对提取的培养基进行灭菌，并增加生物安全的绝缘层。

设计原理：人类β防御素属于抗菌肽（AMPs），对广谱微生物具有非酶抑制作用。肽带正电荷而与带负电荷的细胞膜成分（例如磷脂）进行静电相互作用，增加膜通透性并导致细胞死亡。目前已证明功能性重组 HBD2 使用酿酒酵母表达；大多数关于 AMP 和 HBD2 的工作都集中在治疗领域；HBD2 是人体原生的，对人体非常安全。

综上，该团队选择使用人类 β防御素2（HBD2）作为主要候选药物酿酒酵母作为生物生产和食品生产中大量使用的 GRAS 生物模型，是生产人类β防御素的理想底盘生物。絮凝是指在啤酒酵母中最常见的一种现象。发酵后，酵母会聚集并沉入桶底，由蛋白质Flo1 的产生和分泌诱导。

酵母表面的 Flo1 蛋白与其他酵母细胞壁中的甘露糖残基结合，导致聚集。絮凝比传统的固液分离方法（如过滤、离心或沉淀）更具成本效益。将限制可能最终进入产品的转基因生物的数量，从而增加额外的生物安全水平。

实现方式

该团队创建了一个转基因酵母底盘（如图 1），受到光遗传学控制以诱导人类β-防御素2 表达或启动絮凝，具体取决于酵母所暴露的光的波长。该团队还通过“智能”生物反应器创建了光遗传学细胞-机器接口系统，将与酵母培养物接口，以确定启动生产过程的不同阶段。

图1 NUS_Singapore 团队设计的全基因回路

图2 全基因回路中的组件具体组成

该团队依赖自主开发的三个合成启动子以及一个在 PhiReX 系统中开发的启动子，实现蓝光和红光双通道系统。蓝光启动子 3C120-CYCp-LacO 由 CYC1 启动子组成，包含三个C120 重复序列（EL222 的结合位点）和下游的 lacO 序列。这种结构允许 EL222 二聚体激活启动子，而 LacI 蛋白抑制启动子。3C120-CYCp 是缺少 lacO 序列的变体。tet 抑制启动子 ，PGK1-tetO 来自酵母 PGK1 启动子，与其 TATA box 下游的 tetO 序列融合。

如果产生了TetR，启动子将被抑制。Jub1.1 启动子包含4个Jub1.1 序列是 SynTALE 蛋白的结合靶标。当 SynTALE-PhyB 和 PIF3-VP64 暴露在光下时，与 PIF3 融合的 VP64 激活结构域与截短的 CYC1 启动子非常接近。pAND 通过将 PhiReX 系统中的 Jub1.1 序列与截短的 CYC1启动子融合到下游 lacO 序列中，使其在红光下以与 Jub1.1 启动子相同的方式被激活。

利用双激活-去抑制回路实现紧密的感应折叠。EL222-VP16 由 ACTp 组成，黑暗中EL222 无活性，PGK1-TetO 启动子表达的 LacI 抑制 3C120-CYCp-LacO 的泄漏。当存在蓝光时，EL222 二聚化并激活 3C120-CYCp，驱动 TetR 的表达，从而抑制 PGK-TetO，抑制 LacI 的表达并去抑制 3C120-CYCp-LacO，允许激活的 EL222 驱动 Flo1 的表达。

为了提高蓝光启动子的整体表达，该团队实施了前馈电路（如图 3），当存在蓝光时，正反EL222 的正反馈将酵母的代谢通量转移到 3C120-CYCp 基序上，补充双重压制系统。

图3 蓝光感应增加 EL222 表达的前馈回路

红灯开关：利用分裂蛋白框架（如图 5），PhyB-SynTALE 和 PIF3-VP64 在红光下相互作用，使 VP64 与 Jub1.1 启动子靠近。来自 A. thaniliana 的异源血红素氧化酶（HY1）

和来自集胞藻属的胆蛋白还原酶（PcyA）合成，使该系统能够在红光存在下完全激活 Jub1.1。

图4 红光感应系统开关的部分基因回路

AND 门控终止开关：终止开关与 pAND 启动子相连，在蓝光和红光同时存在时才能激活。在蓝光存在下，pAND 中的 lacO 序列将被解压，但不会被激活来驱动转录。在红光存在下，pAND 中的 Jub1.1 序列被激活，但转录仍被 LacI 抑制。只有当蓝光和红光同时存在时，LacO 才会被解压并被激活 pAND，从而驱动核酸酶杀伤开关的表达。

人类实践

新加坡国立大学 iGEM 团队在过去的一年里，一直在努力与与此问题相关的每个可能的利益相关者进行交谈，以满足参与农业过程的每个利益相关者的需求——从农民和研发科学家到监管机构和消费者，确保 PRYSM 不仅仅是一个理论上的科学解决方案。PRYSM 满足了新加坡同胞的需求，帮助向自力更生的食品未来迈出了一步。

1.了解当地的虫害问题

自“30 by 30”目标开始以来，城市农场持续发展，每个农场都在努力满足营养需求。这些农场使用各种技术和害虫防治解决方案，但在大多数情况下，它们都是“有机”的。该团队与岛上的农场（如图 6）交流了解到：为了保持可持续的耕作方式并满足消费者的需求，新加坡的大多数城市农场都符合这一耕作标准，只使用天然杀虫剂，如印楝油、辣椒油。

图5 NUS_Singapore 团队联系的农场

为了解城市农场的问题以及食品供应链的差距，该团队联系了当地的垂直草莓农场Singrow。与一位农场技术人员进行交谈，技术人员现场介绍了白粉病并表明该农场不使用商业合成杀虫剂来解决。他们尝试使用印楝油等有机杀虫剂，使用硅藻土等预防，但效率很低；采用受控环境农业（CEA）系统，但启动和维护成本太高，且会推高其产品的价格。

他们采访了主要利益相关者——农民，来验证新加坡农场对白粉病解决方案的需求。他们从当地大型和小型农场以及采用不同耕作技术的农场寻求专家，包括室内水培农场、室内土壤农场、屋顶水培农场和室外土壤农场。该团队了解到：所有农场，尤其有机农场，都需要一种生物解决方案以控制白粉病等真菌病原体的传播。它必须有效，且解决有关其安全性、成本和可持续性的问题。

2.定义好的解决方案

鉴于资源和时间有限，该团队优先考虑大多数当地农场所需资源。农场的生物农药需求可以归纳为 8 个关键：有效对抗各种微生物病原体；安全获得新加坡食品局（SFA）的批准；一种生物制品，可用于有机农场；无外来遗传物质；成本低廉；经济高效的纯化；系统能根据农场中存在的害虫类型生产杀虫剂；易于操作。后续该团队咨询了新加坡市场上现有的害虫解决方案以及市场空白。新加坡食品局（SFA）监管和注册用于种植新加坡消费作物的农业农药。为开发更安全生物农药，寻找天然存在于人体内的抗菌蛋白或可安全食用的抗菌蛋白，但生产成本高。

除此之外，他们向转基因咨询委员会（GMAC）寻求监管信息。GMAC 评估了转基因生物研究和向环境中释放的风险，以及将修饰基因整合到其他物种中的风险。对于生物生产研究，他们强调了生物反应器设计对确保生物安全的重要性。

3.构思解决方案

他们咨询了基因工程和硬件设计领域的专家，并根据他们的反馈迭代改进了设计，以达到最终解决方案旨在实现的不同设计原则。

他们从 Singrow 的 Bao Shengjie 博士得到生物反应器设计的要求，必须考虑硬件的总体成本。因而他们决定将 POC 设备缩小到台式规模，总工作体积为 100 mL，以确保成本低，更换零件的可及性很高。并使用红外温度传感器进行精确的温度检测，使用红外二极管和检测器系统进行 OD 测量。

他们从 Addison Wong 博士那里得知纯化是生产过程中成本最高的步骤。因而他们的生物反应器采用了振荡曝气方式，使酵母菌株有效絮凝。通过结块和沉淀过程，絮凝使修饰的酵母沉入烧瓶底部，上清液几乎不含细胞，从而减少昂贵纯化费。

4.实施和评估

为了了解消费者对农药使用的厌恶，该团队在新加坡当地社区设计了一项消费者态度调查，以了解他们对生物农药与商业农药相比的开放程度和看法。超过一半的受访者对在农作物中使用传统农药表示担忧， 80%的受访者对使用生物农药持开放态度。结果表明，虽然生物农药越来越常见，但仍有消费者有担忧，他们强调需要适当的公众教育活动。

5.教育

与南洋理工大学（NTU）iGEM 合作，组织研讨会μBioMachines。μBioMachines 面向大学预科生，旨在向大学预科生推广合成生物学的基础知识，使其成为新兴领域。他们与新加坡国立初级学院（NJC）合作，并将该活动推广到新加坡的其他中学机构。他们为该活动的不同年龄受众设计了不同 PPT，激发学生在进一步的学术追求中追求合成生物学。

他们组织了“构建自己的电路”活动用于模拟 BioBricks 概念，创建了 Miro 板，允许根据给定的不同条件在设计电路时进行远程协作。该系统易于修改，并且可以轻松扩展以包括更复杂的问题，作为协作探索 BioBricks 概念的工具。

该团队成员还与参加合成生物学、BN4501 工程生物学等不同 LSM3246 课程的学生进行了简短的分享会和讲座，并概述现实生活中的合成生物学应用，解释 iGEM 的内容。

经过人类实践访谈和消费者调查，该团队发现消费者对生物农药及其安全性的认识存在差距。通过研究和外展，他们意识到更好的意识和教育可以影响生物农药进入新加坡市场并制作了一个简短的、内容丰富的视频，说明了什么是生物农药，以及它们如何作为一种环保、人类友好、商业化的农药替代品。

在进行综合人类实践时，他们咨询了 Vaciome，一家专门从事 AMP 发现和生产的合成生物初创公司。通过讨论发现该公司有一个用于毕赤酵母的 HB2 构建体，可以很容易地移植到酿酒酵母中。他们为我们的 iGEM 项目捐赠了 HBD2 构建体样品，节省了该团队用于合成的资源。

个人评价

由于时间限制，该团队没有将整个光遗传学回路转移到 P. pastoris 中。值得我们学习的地方是该团队利用 HP 联系了许多公司，获得了赠送的 HBD2 构建体样品，节省用于合成的资源，降低了项目推进的难度与成本.

该团队使用红蓝双色光设计了双激活-去激活的光遗传学表达开关，驱动菌体自杀，可以借鉴。该团队没有详细做商业规划、资金投入和收入预估等 Hp 项目，尤其对于他们这种应用到农业生产（较易实验）的商业产品，显得项目没有很好的收尾，是缺陷所在。