XMU-iGEM 2024课题分享
1、课题标题
StarchLight——Ionis_Paris
2、课题背景
当今世界上的可持续能源大多数都不够稳定——风力、水力、太阳能等清洁能源都很容易受天气环境的干扰，能源不仅面临着生产问题，还面临着储存问题。所以该团队想要寻找能够存储可持续能源的方法来解决清洁能源的按需生产和持续供能问题。于是他们将目光放到了希瓦氏菌（S. oneidensis）上，并开始寻找可以作为希瓦氏菌生长基质的有机葡萄糖废物。
团队同时也注意到了面包店废料和酒糟这两个有机葡萄糖废物来源，在深入了解相关行业后，发现酿酒厂中每年产出中约有17%是酒糟，其中大部分酒糟被焚烧，不能够重复利用，所以团队想针对酒糟利用来设计他们的课题。
课题原理
2.1 大肠杆菌
项目的最初设计是首先通过表达淀粉酶的E. coli将酒糟中的淀粉降解为Glc，在经糖酵解生成乳酸，同时为了能够储存能量，团队用丙酰辅酶A转移酶将乳酸转变为乳酰CoA，再通过聚羟基链烷酸酯（PHA）合酶将乳酰CoA转变为聚乳酸（PLA）来构建储能系统。
在PLA的降解方面，团队选用了光敏结合蛋白EL222作为开关来控制PLA降解为乳酸为希瓦氏菌供能发电。EL222于465nm蓝光激活下与DNA结合，激活RNA聚合酶募集和转录激活，控制PLAase的表达。
Figure 1 大肠杆菌的酒糟分解与聚乳酸生产
2.2 希瓦式菌
在蓝光照射下，大肠杆菌开始分解PLA，而从PLA降解出的乳酸则能够为希瓦氏菌提供碳源来发电。希瓦氏菌能够形成促进其与氧化金属之间接触的生物膜，并将其内膜中的电子通过细胞色素传递到金属上进行氧化呼吸。
Figure 2 大肠杆菌功能与希瓦氏菌发电过程的偶联
其中MtrC在对金属还原方面起到至关重要的作用，故该团队欲将他们使用的希瓦氏菌转化为过表达MtrC的菌株。
Figure 3 希瓦式菌的胞外电子传递
2.3 微生物燃料电池
团队运用前述的两种细菌来组装了他们的生物燃料电池（MFC）。
Figure 4 微生物燃料电池
如上图所示，在左一隔室中有E. coli负责降解酒糟后生成PLA，在465nm蓝光激活下释放乳酸；乳酸通过乳酸选择性膜进入含有希瓦氏菌的阳极室，希瓦氏菌在阳极上生成电子并向溶液中释放质子；质子通过质子交换膜进入阴极室，电子通过外部线路进入阴极；在阴极室中e-、H+和O2生成H2O。
实验结果与分析
3.1 质粒构建和表达验证
团队使用酶切酶连的方式构建质粒，在菌株中导入相关质粒（包括mtrC过表达的质粒）后表达，裂解菌体提取蛋白质，经过SDS-PAGE鉴定，成功验证了EL222、AmyH、LDH、PHAC1、PCT质粒的表达，而PLAase和mtrC过表达质粒仍需进一步验证。
3.2 验证E. coli利用酒糟产生乳酸
3.2.1 验证酒糟中淀粉的存在
对于验证酒糟中淀粉的存在，课题团队用3g酒糟+30ml PBS+10ml蒸馏水制作出预制酒糟溶液，在以下条件过夜培养：
表1
随后在各管中加入30μl Lugol溶液（含有I2，特异性染淀粉），结果显示，60℃过夜PBS处理的酒糟较37℃下淀粉量更多。
为定量测定酒糟中得到的淀粉浓度，课题团队用吸光光度法构建了OD530-淀粉浓度标准曲线，最终测得37℃酒糟淀粉浓度0.59g/L，而60℃处理的样品淀粉浓度为1.01g/L。
3.2.2 验证E. coli在酒糟中的生长状况
为了探究酒糟中是否有其他菌株的污染，团队用三种培养皿进行验证，其中无论酒糟是否灭菌（板1、2），其在LB培养基培养后均出现菌株污染，而PBS培养的酒糟没有出现污染。故用PBS先提取淀粉是更好的选择。
表2
团队使用用PBS+酒糟为基础进行验证（培养基污染就不做实验，有一点点离谱呢），分别用过夜的含有0.2g/L Glc和7.5ml PBS+酒糟的不含额外碳源培养基对E. coli培养36h，发现两种培养基中菌体都能够较好的生长。通过以上实验，团队不仅证明可以用PBS过夜提取酒糟中的淀粉，也证明了E. coli能在此体系中正常生长。
3.2.3 验证α-淀粉酶基因在E. coli中的表达
该团队提取质粒并用限制性内切酶SacI和PstI进行酶解后进行电泳发现有目标条带。于是，团队将目的质粒转入BL21菌株，但尴尬地发现，阳性与阴性菌子在Lugol试剂中没有显著区别。
经过检查，团队发现该质粒的T7启动子从23bp截短到了10bp，后续通过回路重构进行再次实验才做出了明显区别，在转入新重组质粒的BL21成功表达淀粉酶AmyH后，团队进行了进一步测量分析。
WT菌株和AmyH转化BL21分别用含0.2g/L淀粉的固体培养基培养，随后用Lugol试剂检测，其中，菌落降解淀粉会在其周围形成透明圈，不同NaCl浓度对淀粉降解稍有影响，淀粉降解能力可用Vun表示（Vun = Vunstained area-Vcolony）。根据以下实验数据，可看出AmyH 转化的BL21有更强的降解淀粉的能力。
表3
AmyH在BL21中成功表达后，团队着手将正确的片段在pSB1A3质粒中组装完整。
3.2.4 验证转化后E. coli生成乳酸
乳酸脱氢酶质粒（有两种，LDH1和LDH2）转化的E. coli通过D-乳酸检测试剂盒检测，此试剂盒有A酶和B酶，分别检测内源性LDH活性，可以用A+B（指两种酶共同检测，检测内源活性）或仅用B酶检测（作为对照）。检测结果显示，LDH2转化的E. coli产生的LDH浓度更高。
3.3希瓦氏菌发电和硬件设计
团队首先用两个50ml离心管（每个离心管上都有4×1 cm的开口）头对头并在中间夹如一质子交换膜来构建了一简易硬件，如下图所示：
Figure 5 一个粗糙的硬件
他们在每管中加入35 ml LB培养基，于阳极室中加入OD600值为0.7的希瓦氏菌250 μL，待菌体在金属阳极上形成生物膜的同时测量菌体产生的电力。团队一共测试了5组数据，其中使用的维生素B2（核黄素）浓度为37nM；E. coli p150指产生吩嗪-1-羧酸的E. coli，与转化入过表达mtrC质粒的希瓦氏菌共培养。
Figure 6 希瓦氏菌发电
结果如上图所示，在培养20～30 min后所有组别电压均达到最大值，其中mtrC with riboflavin + 10mM lactate组电压最大（28 mV）与其他组别保持10mV以上的差距，NT和转化入过表达mtrC质粒的希瓦氏菌在10mM lactate培养下差距不大，NT组几乎无电压稳定的平台（最大值为3 mV），所有组别在9h电压降至基线。但是mtrC with E. coli p150 + 10 mM lactate组的产电过低，怀疑可能是E. coli和希瓦氏菌共培养竞争，团队预计之后通过单独分离出吩嗪-1-羧酸进一步实验。以上结果证明了希瓦氏菌以乳酸产电的可行性，并证明了核黄素能够显著提高菌体的产电效率。
实现方法
4.1 模型设计
团队的MFC具体反应可以简化为：
Figure 7 简化后的反应过程
团队基于以上反应式，通过微调各数据来以模型拟合实验数据，当预测数据和实验数据接近时，便能够用模型预测来优化设备。
4.2 硬件设计
在之前设计的简易模型中，电压可测量，而电流过低，所以团队在后续硬件的设计中将每种细菌的容器尺寸增加到500mL。
Figure 8
如上图所示，电池外壳上有4个入/出口阀，用于更新细菌培养液；箱体长度短而深度和宽度大，使电极和溶液 / 菌体接触面积增大的同时，便于离子 / 粒子在各池之间扩散；电池上方有上盖保证气密性，隔绝细菌带来的风险；电极上有很多的贯穿孔进一步增大接触面积和促进介质流通，其中阳极团队欲选用原铝阳极（金阳极太贵，而铜 / 银阳极对细菌有毒性）；电池体壳大部分元件团队欲选用3D打印，容易获取的同时，材料又足够坚固并对细菌无危害。
个人评价
该项目展示了一种创新的利用工业废弃物来生成能源的方式，不仅有助于减少环境污染，还为可持续能源开发提供了新的思路——生物转化储存。
这个课题涉及到废物处理的问题——大规模酿酒过程会产生大量酒糟，如果处理不当，可能会对环境造成负面影响。传统的处理方法也和造纸非常相似，例如填埋或焚烧，但这会增加温室气体排放和土地污染。
并且该课题还谈到解决的问题和水资源、温室气体的排放、土壤资源等等方面的联系，这对于我们今年课题各页面的背景介绍提供了很好的角度，在这个分析思路下，待解决的这些重要问题都能够和全球性问题联系起来，这些问题如果能在一定程度上被解决的话，将会让更多人感受到我们项目的意义，这些分析逻辑对我们的课题引入和呈现也非常有帮助。
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