iGEM 2023
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Biology and evolution of bacterial toxin-antitoxin systems
DOI: 10.1038/s41579-021-00661-1IF: 78.297 Q1 B1
背景与介绍
本文章对毒素-抗毒素领域的进展进行了全面综述。它描述了毒素-抗毒素系统的分类，它们在不同水平上的调节方式，以及毒素的分子作用模式。回顾了过去关于毒素-抗毒素系统的研究和最新进展，并讨论这些模块在基因组进化中发挥主要作用的可能性。
此外，这篇综述还提供了毒素-抗毒素系统的天然特性的使用实例，即作为生物技术和医疗工具等。最后，它总结并提出了一系列亟待解决的问题，对该研究细分领域的未来提出展望。
毒素-抗毒素系统分类
I：类型一（hok-sok）
除了I型和VIII型系统之外，编码毒素抗毒素的基因总是连锁的，通常以操纵子的形式存在。
抗毒素基因转录出反义RNA特异性结合毒素基因mRNA，抑制毒素蛋白的表达。
II：类型二（ccd）
抗毒素基因转录表达抗毒素蛋白，与毒素基因表达的毒素蛋白中和，维持稳态。
III：类型三
抗毒素基因编码Pseudoknot RNA，这些小RNA与毒素蛋白的作用靶点相互作用并隔离毒素蛋白的作用位点，解除其影响。
IV：类型四
抗毒素基因编码蛋白质抗毒素，并与毒素蛋白的作用靶点相互作用以隔绝毒素蛋白的影响。
V：类型五
抗毒素基因编码核酸内切酶，特异性降解毒素蛋白的mRNA，阻止其翻译过程。
VI：类型六
抗毒素基因编码毒素基因的特异性降解标记，诱导毒素蛋白在蛋白酶的作用下降解。
VII：类型七
抗毒素基因编码蛋白酶可以将毒素蛋白进行转录后修饰，使其失去功能。
VIII：类型八（creT–creA）
抗毒素基因转录出反义RNA干扰毒素基因表达。
抗毒素基因转录出的RNA模仿CRISPR-RNA的功能去招募Cas蛋白并构成复合物，抑制转录。
毒素-抗毒素系统的调控方式
总体而言，机体内的抗毒素水平会高于毒素，以维持稳定状态，这在各级层面上有着精准的调节机制和过程。
（一）转录水平的自我调节
一般而言，毒素抗毒素系统的基因顺序为抗毒素基因在前，而毒素基因以极小的间隔连锁其后，或者享有重叠的的ORF（开放阅读框）。这样的排布顺序可以优先保证抗毒素的供应，使其浓度水平在没有扰动的情况下高于毒素，维持稳定。
图中的转录水平自调节机制，绿色的抗毒素蛋白由两部分组成，分别为DNA结合结构域（识别回文序列），毒素结合结构域。在抗毒素过量的情况下，抗毒素蛋白结合在启动子上抑制毒素抗毒素系统的转录表达，而当毒素过量并饱和结合抗毒素时，毒素抗毒素蛋白复合物从启动子上脱离，重新开启该系统的表达。
（二）转录后水平的调节机制
在转录后水平的RNA-AntiRNA调节机制中，其反义 RNA 一般在RNA的互补链中进行编码。
在抗毒素基因转录出与毒素mRNA 相结合的反义RNA 存在的情况下，抗毒素反义 RNA与毒素mRNA相互配对作用，抑制核糖体对mRNA的识别结合，最终该复合体将被双链特异性的RNA降解酶降解，从而抑制毒素功能的正常发挥。
在抗毒素RNA不存在的情况下，该 mRNA的配对结构可以在核糖体结合后发生调整，并使得核糖体可以与 mRNA 中的RBS结合，并最终导致毒素蛋白的翻译。
（三）翻译后水平的调节机制
细菌的翻译后水平调节机制纷繁复杂，蛋白质一经合成，便通过各种机制进行调节：毒素与抗毒素形成复合物而被中和、毒素催化位点的封闭、形成阻止毒素接近其底物的空间位阻、毒素空间二级结构的破坏 、抑制毒素二聚体相互活化作用等等...具体案例详见上述毒素类型机制介绍。
毒素活性靶点
通常情况下，毒素是在宿主细胞的细胞质中或内膜中的具有较小活性的单域蛋白或肽，最近有研究将RNA毒素也纳入其中。
毒素的作用机理主要分为四个部分：①毒素损伤DNA以及其复制过程；②毒素分解RNA或者妨碍翻译过程；③毒素损害细胞膜或细胞骨架；④诱导代谢应激毒素的产生。
（一）毒素损害DNA及其复制
1.CcdB型：诱导复制叉的崩溃，从而导致双链断裂，诱导SOS反应和细胞死亡。
2.FicT型：抑制ATP水解活性，抑制复制过程。
3.DarT型：将ADP核糖片段从NAD+转移到单链DNA上，引起DNA损伤并引发SOS反应。
4.SocB型：通过直接与DNA聚合酶的β-滑动钳相互作用，从而破坏DNA复制的持续性。
5.RalR型：切割甲基化和非甲基化的DNA。
（二）毒素分解RNA或阻碍翻译
1.MazF型：以低特异性降解游离的RNA。
2.VapC型：特异性地切割反密码子茎环。
3.RelE型：在核糖体中切割RNA。
4.HipA型：特异性磷酸化氨酰基tRNA合成酶，从而抑制特定地tRNA。
5.Doc型：磷酸化并使延长因子EF-Tu失活，从而抑制tRNA向核糖体转移。
6.ToxSAS型：将焦磷酸片段从ATP上转移到tRNA受体地CCA端来进行阻断。
7.MenT型：将嘧啶连接到受体茎上，进而阻断。
8.HEPN型：切割tRNA的受体茎。
9.CreT型：捕获稀有的tRNA，从而阻止翻译的进行。
10.AtaT型：使氨基酸乙酰化。
（三）毒素损害细胞膜和细胞骨架
1.CbtA型：与隔膜蛋白FtsZ和细胞骨架蛋白MreB结合，抑制两者的聚合。
2.TisB/HoKB型：引起膜的去极化，破坏质子动力。
3.GhoT型：利用两个穿膜螺旋，进而引起影细胞。
4.ζ型：抑制肽聚糖、脂多糖的合成，从而抑制细胞壁的合成。
（四）诱导代谢应激毒素的产生
1.ToxSAS型：通过消耗ATP/GTP产生(p)
ppApp/(p)ppGpp来抑制细胞的翻译过程。
2.MbcT型：水解消耗NAD+。
毒素-抗毒素系统的生理效应
该系统的生理效应主要有三个板块：①细菌生理和适应性调节；②作为抑菌应激模块和参与抗生素持久性的休眠效应；③与基因组之间的冲突。
（一）细菌生理和适应性调节
MazEF作为许多应激条件下控制细胞程序性死亡的自杀模块。这里的应激条件包括了氨基酸匮乏、DNA损伤、胸腺嘧啶无性死亡、氧化应激和抗生素治疗等。上述的应激条件被提出使以ppGpp依赖的方式引起MazE抗毒素的消耗，而MazF则会以一种选择性的方式导致翻译被抑制。这种选择性的翻译会导致绝大多数细胞种群的死亡，从而将营养物质释放给存活的细胞。
根据以上提出的翻译重编程的概念，可以进一步的扩展PCD模型：一个MazF调控子在其5’非翻译区含有ACAMazF切割位点的基因组成，而当MazF被激活时，切割作用会优先发生在这些位点上，同时MazF会在16SrRN的3’端切割ACA位点，从而消除anti-Shine-Dalgarno序列，从而产生专门的核糖体，而这些核糖体就会优先翻译构成MazF调节子的mRNA。
（二）作为应激模块和参与抗生素持久性的休眠效应
有研究表明，异位诱导MazF和II型毒素RelE具有抑菌作用，它们可以通过共同表达他们的同源毒素来挽救，而这些毒素的过度表达已经被证明使可以通过切割mRNA来减少翻译，且两个系统都被证明是可以在氨基酸匮乏时以(p)ppGpp不依赖的方式进行上调。
在大肠杆菌Δ10菌株（含MazF和RelE系统）中，多种毒素-抗毒素系统缺失导致暴露于氨苄西林和环丙沙星后持久性会逐渐降低，这说明毒素-抗毒素系统是冗余的。
毒素-抗毒素系统激活的信号级联：(p)ppGpp在存活细胞中的随机积累会通过合成多磷酸导致Lon蛋白酶的激活，进而导致抗毒素的蛋白水解、毒素释放和这种翻译的阻滞。这种（p)ppGpp依赖性毒素-抗毒素系统诱导的“休眠”会导致一些中毒细胞暂时耐受抗生素治疗，并且在抗生素被去除后恢复生长。
（三）与基因组的冲突
一些观点认为毒素-抗毒素系统的基因是自私的，因为它们在基因组中分布不均匀，容易产生水平基因转移。同时，它们促进自身的垂直传播，从而使携带它们的复制子受益，甚至会牺牲宿主细胞；除此之外，该系统还会参与基因组冲突。
质粒编码的毒素-抗毒素系统通过一种PSK机制来促进复制子的垂直遗传，而因为抗生素的内在不稳定性，不能遗传毒素-抗毒素系统编码质粒会导致抗毒素耗尽和没有质粒的细胞被杀死。
图a表示的是II型系统介导的质粒成瘾依赖于毒素（红色）和抗毒素（绿色）蛋白之间的差异稳定性。不能遗传质粒的子细胞中，抗毒素将不会再得到补充，毒素将会从毒素-抗毒素复合物中被释放出来，并杀死细胞，从而使得质粒得到维持。抗毒素是可以隔离质粒编码的毒素，从而保护细胞在质粒丢失的时候被杀死。
作为噬菌体防御机制的毒素-抗毒素系统，其也可以作为流产感染系统：既能够杀死受感染细胞来阻止噬菌体扩散的基因。而已知的噬菌体防御现象已经在几种类型的系统中被发现。例如hok-sok系统、rnlAB系统、toxlN系统和abiE系统。
图b表示的是就是抗噬菌体和噬菌体的中和系统。III型系统街道的抗噬菌体机制依赖于毒素（红色）和RNA抗毒素（绿色）之间的差异稳定性。在噬菌体感染的细胞中，宿主基因的转录会受到抑制，不稳定的抗毒素无法被补充，因此毒素会被释放，并且能够降解噬菌体的转录物，进而阻止噬菌体的形成来阻止噬菌体的繁殖。
毒素-抗毒素系统进化
（一） 毒素-抗毒素系统的动力学
毒素-抗毒素进化的主要原因：①与 MGEs 的关联；②自私的本性。
MGEs 是毒素-抗毒素系统的有效载体，因为它们具有自转座和/或可传播的性质，几乎所有的MGE都带有毒素-抗毒素系统。实验进化分析表示，编码 HEPN-MNT 系统的转座子转置到感兴趣的质粒中，从而增加其稳定性。
毒素-抗毒素系统很可能通过水平转移沉积在染色体中，例如，大肠杆菌 K-12 菌株中的大多数 II 型毒素-抗毒素系统在肠杆菌质粒中具有密切的同源物。这主要是由于毒素-抗毒素系统的成瘾性，即使没有对整个元素施加选择压力，携带毒素-抗毒素系统的质粒或 MGE 通常可能稳定整合到染色体中。而MGE可能会在之后衰减，只留下毒素-抗毒素系统。
多项研究发现毒素-抗毒素系统通常构成基因组胰岛；从一种菌株到另一种菌株具有高度可变性，即使在同一物种内也是如此，这两点进一步证明了毒素-抗毒素系统很可能通过水平转移。
如图所示，在大肠杆菌的四个种群中，毒素-抗毒素系统很少从一种菌株到另一种菌株是保守的，即使在同一个谱系群内：
①一些毒素-抗毒素系统在一个系统群（例如，mqsRA）或多个系统群（例如，prlF-yhaV 和 hipBA）中表现出准普遍的保守性，表明这些系统在系统群内垂直传播；
②一些系统几乎是普遍保守的（例如，prlF–yhaV），其他零星地出现在系统发育过程中，没有明确的模式（例如，chpB 或 relBE），表明通过水平基因转移进行了多个获取事件；
③而一些具有非常强遗传连锁的毒素-抗毒素系统（例如，dinJ-yafQ 和 yafNO，相距 6 kb）在这些基因组中没有表现出强烈的共现性，这表明这些系统可以独立于水平获得彼此，并通过多次进化。
毒素-抗毒素系统被认为通过净化选择而分化。净化选择，指选择性地清除对生物体有害或减弱适应度的突变。它的进化受遗传漂变影响，如果出现使毒素失活的突变或重排就会衰退并消失。如大肠杆菌中hok-sok系统以及 ccd 系统的退化就是源于点突变导致的毒素失活。而毒素-抗毒素系统在基因组还原进化过程中处于中间活跃状态，与基因组进化有密切关系，它的大量存在可能与特定物种的基因组可塑性和强烈的基因通量有关。
移动遗传元件 (Mobile genetic elements, MGEs) 如质粒、噬菌体、基因组岛、转座子和插入序列等是能够在细胞内外移动、携带编码特定功能基因的基因组片段，在生物体基因转移和基因重组方面以及物种进化方面起着不可小觑的推动和调节作用，并且一直是研究的热点。MGE 也是横向基因转移事件的指示物，代表着生物体对不同环境的主要适应性机
（二）毒素-抗毒素系统的多样性和模块化
尽管一些毒素结构相似，但具有不同的作用模式。这表明它们很可能起源于一个共同的祖先，并在进化过程中分化。
在一个毒素-抗毒素复合体中，抗毒素会高度专一地识别和中和某一种毒素，II型抗毒素具有DNA结合结构域，采用各种折叠（HTH，RHH，SpoVT-AbrB和Phd-YefM）调节毒素-抗毒素操纵子的表达，这些结构域不与任何毒素家族相关），使Ⅱ型系统具有模块化特征。不同的毒素和抗毒素可以“混合匹配”，也为新系统的生成提供了可能。
（三） 多态毒性系统的储库
大多数毒素-抗毒素系统中编码的毒素可以在其他环境中找到，如多态性毒素系统分泌的效应蛋白和一些III/IV/VI型分泌系统的效应因子与毒素蛋白等的结构相似。一些研究追溯了毒素-抗毒素系统和分泌效应器之间的进化联系，说明毒素-抗毒素系统和某些分泌系统可以相互作为新的效应因子的储备库，反之亦然。
多态性毒素系统是广泛存在于细菌中的编码毒性效应蛋白的系统，这些蛋白的羧基端可以连接高度多样的毒性结构域，其中一些与毒素-抗毒素系统的毒素结构相似。
总结
文章对毒素-抗毒素的多样性与作用机制进行了详细的概括总结。在此基础上，通过对系统的基因活动描述，包括系统在细菌基因组中的强大扩张与基因组岛的关系、系统参与基因组冲突的小自私模块（有利于维持携带它们的复制子）、系统随着基因组和宏基因组数据的指数级增长等，以及对转录翻译过程毒素-抗毒素的结构研究，分析了毒素-抗毒素系统在生物中进化特点与原因。
同时，文章提出了一些未解决的问题，包括染色体毒素-抗毒素系统是否保留介导PSK的能力，激活毒素-抗毒素系统的关键因素是什么等等。
此外，这篇综述还提供了毒素-抗毒素系统作为生物技术和医疗工具应用的实例。
参考文献：
Jurėnas D, Fraikin N, Goormaghtigh F, Van Melderen L. Biology and evolution of bacterial toxin-antitoxin systems. Nat Rev Microbiol. 2022 Jun;20(6):335-350.
The End
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