文献分享 Biosafe：遗传生物遏制系统——综述

文献标题：Genetic Biocontainment Systems for the Safe Use of Engineered Microorganisms Journal：Biotechnology and Bioprocess Engineering

网址：https://doi.org/10.1007/s12257-020-0070-1

关键词：合成生物学；生物容器；转基因生物；营养缺陷；异源生物学

主要内容：

本综述介绍控制微生物增殖和遗传材料释放的生物封闭系统，主要侧重于消除细胞和 DNA 的遗传手段。用具有代表性的例子概述了每个生物封闭系统，强调了其优缺点。还讨论了遗传生物遏制系统为实际用途而应克服的未来挑战。

一、针对菌株

（一）营养缺陷

限制工程微生物增殖的最简单方法之一是使用参与氨基酸或核酸生物合成途径的必需基因。通过删除不同的必需基因并补充必需基因合成的营养素，我们可以使工程细胞的生长依赖于营养素。这种微生物依赖特定营养物质的生物遏制系统称为营养缺陷型生物遏制系统。营养缺陷型生物防护系统可使用不同类型的营养物质，包括核苷、亚磷酸盐和 CO₂。

举例：

（1）将来自乳酸乳球菌的腺苷酸合酶基因 thyA 替换为人 IL10 基因以产生腺苷酸营养缺陷型。

（2）消除在乳酸乳球菌中编码 CTP 合酶的 pyrG 基因，以获得胞嘧啶营养缺陷型。

（3）消除大肠杆菌菌株中的所有磷酸盐和有机磷酸盐转运蛋白，并引入了亚磷酸盐转运蛋白 HtxABCDE 。在该系统中，细胞只有在外源供应无机磷酸盐时才能存活。当在细胞内构建亚磷酸盐-营养缺陷型生物围护系统时，21天未观察到逃逸突变体，表明宿主细胞绕过生物围护系统概率的逃逸频率为 1.94×10^-13 。

（4）蓝藻聚球藻中的羧基体壳蛋白缺陷，使细胞依赖于高 CO₂ 浓度。在水生系统中，CO₂ 浓度很低，因此 CO₂ 浓缩机制对于增加局部 CO₂ 浓度使其足以让细胞存活至关重要。羧基体壳蛋白的缺失中断了 CO₂ 浓缩机制，从而损害了蓝藻的生长。当供应至少 5% 的 CO₂ 时，高 CO₂ 依赖PCC7002 菌株存活，并且该菌株在大气（~0.04% 的 CO₂）中的存活率小于 5×10^-10 。

优点：

使用现成的小分子作为生存信号分子，稳健性、可操作性强。

缺点：

营养缺陷型生物防护系统有几个固有的局限性。由于工程微生物的生长完全依赖于必需的营养素，如果同一环境中的其他生物体提供必需的营养素，生物防护系统可能会失效；使用含有所有可能的必需营养素的丰富培养基可以使营养缺陷型生物防护系统失效；营养物的稳定性可能是在指定环境中维持工程微生物的关键因素。

最后，由于营养缺陷系统只控制细胞的增殖，而不控制遗传物质，因此它不能阻止在开放环境中通过水平基因转移 (HGT) 释放遗传物质。

（二）基于条件诱导

另外，去除编码必需营养素合成酶的必需基因通常会导致宿主细胞生长迟缓。这种情况下，充足的营养供应对于维持细胞生长变得非常重要。有条件地抑制必需基因表达不是永久删除必需基因，则是可以替代营养缺陷型生物防护系统。为实现这一目标，研究人员一直在使用诱导型启动子和这些启动子的组合来调节必需基因的表达。

举例：

（1）使用诱导型启动子来调节酿酒酵母中编码组蛋白的必需基因。分别引入了半乳糖和雌二醇诱导型启动子 PGAL1 和 PGAL7。 PGAL1 和 PGAL7 启动子通过调节组蛋白 H3 基因 (HHTS) 和组蛋白 H4 基因 (HHFS) 来控制酿酒酵母的细胞生长。系统的逃逸频率小于 10^-10 。阿格蒙等人。

（2）使用雌二醇诱导型合成 SPAL 启动子来控制几个必需基因（FAS2、HTS1、RPB11、SEC17 和 SEC4），系统的逃逸频率约为 10^-8 。

（3）除了生存信号的外源性补充外，内源性分子可以作为提示分子来激活必需基因的表达。使用群体感应分子酰基高丝氨酸内酯 (AHL)，其浓度随着细胞密度的增加而增加，以驱动抗生素抗性基因表达。（是不是可以考虑使用在干旱条件下或者寒冷条件下细菌自己产生的某种物质去诱导存活基因，当胁迫因素消失时，该种内源物质消失，细菌死亡。） 结果，高浓度的宿主激活了抗生素抗性基因，使宿主细胞得以存活。然而，在低浓度下，不会诱导抗生素抗性基因，导致细胞死亡。

（4）对五个必需基因（pheS、dnaN、tyrS、metG 和 adk）进行定向进化，以产生苯并噻唑依赖性必需酶。在苯并噻唑存在的情况下，细胞可以正常生长，但在没有苯并噻唑的情况下，必需的酶会失去活性，导致细胞死亡。2个必需基因的组合显示出 5×10^-10 的逃逸频率，3个必需基因的组合进一步将逃逸频率降低到 3×10^-11 的检测限以下。研究人员没有操纵启动子区域，而是产生了对必需酶的配体依赖性，并将配体用作生存信号。

优点：

系统易克隆，基于条件必需性的生物遏制系统仅依赖于指定的诱导剂及其相应的启动子，此功能允许系统以最小的改动扩展到不同的宿主菌株。此外，由于在环境中很少发现指定的诱导剂，因此基于条件必要性的生物防护系统没有交叉喂养问题。

缺点：

基于条件必要性的生物防护系统无法在开放环境中防止 HGT。

（三）基于毒素

典型的基于毒素的生物防护系统旨在表达毒素以响应指定未经授权条件的信号分子，从而导致细胞死亡。

举例：

（1）构建一个基因表达盒，将 hok 表达为响应大肠杆菌中色氨酸耗竭的毒性基因。当培养基中的色氨酸耗尽时，会合成毒素 hok，破坏细菌细胞膜，导致细胞死亡。施韦德等人。设计了一个类似的系统负责大肠杆菌中的磷酸盐消耗。同样，Contreras 等人。使用 gef 作为有毒基因，并设计了导致大肠杆菌中苯甲酸盐消耗的遗传回路。这种依赖苯甲酸盐的生物防护系统是为设计用于从环境中去除污染物苯甲酸盐的细胞而构建的。当细胞降解所有苯甲酸盐时，生物防护系统会激活 gef 的表达并抑制宿主细胞的生长，自动将整个种群从环境中移除。此外，在依赖苯甲酸盐的生物防护系统中使用两个拷贝的 gef 基因提高了工程大肠杆菌和恶臭假单胞菌的杀灭效率。设计了来自 Streptomyces avidinii 的致死链霉亲和素基因的表达，以响应恶臭假单胞菌中 3-甲基苯甲酸盐的消耗。

（2）构建了一个基因表达盒，可检测酿酒酵母中的低水平葡萄糖并允许表达有毒的 relE 基因。同样，Balan 等人。用来自酿酒酵母中粘质沙雷氏菌的致死核酸酶基因构建了一个低葡萄糖反应回路。

（3）使用温度依赖性转录抑制因子 TlpA36 来调节抗毒素 CcdA，但表达毒素 CcdB 不受调节。TlpA36 在低温（< 30^oC）下抑制 TlpA 启动子的转录并降低抗毒素 CcdA 的表达，导致细胞死亡。（反过来想，将TlpA放在Ccd前面，低温时抑制毒素的表达，高温时上调，细胞死亡。就是这个温度阈再低点就好了15^oC左右）斯特林等人使用冷休克蛋白 A (PcspA) 的温度敏感调节区来调节毒性基因 CcdB。调节区的长 5' UTR 在低温（< 22^oC）下激活翻译，形成稳定的结构，允许 CcdB 的高表达。

优点：

该系统可以通过毒素主动诱导细胞死亡，并且设计起来相对简单。

缺点：

毒性基因通常会导致细胞生长迟缓，因此应严格控制毒素的表达。此外，有毒基因的随机突变会导致生物防护系统功能丧失。

（四）多种杀伤机制的组合

由于营养缺陷型系统、基于条件必需性的系统和基于毒素的系统具有明显的缺点，因此许多研究试图将它们结合起来以提高生物防护性能。联合生物防护系统通常是有益的，因为它们可以降低使生物防护系统失效的致命突变的可能性。

举例：

（1）通过将基于毒素的系统与基于条件必要性的系统相结合，开发了一种高性能的生物防护系统。首先引入 3-甲基苯甲酸诱导型启动子以抑制 P. putida 中编码毒素的 gef 基因的表达。然而，该系统仅在土壤环境中表现出较弱的杀伤效率和相对较高的逃逸频率（10^-8）。然后，将其与基于条件必要性的系统相结合。从染色体中去除了必需基因 asd，并用 3- 苯甲酸甲酯诱导型启动子重新插入了 asd 基因。这样一来细胞生长依赖于 3-甲基苯甲酸酯的供应。通过结合对 gef 的抑制和对 asd 的诱导以响应 3-甲基苯甲酸酯，逃逸频率降低到 10^-9 的检测限以下。

（2）使用编码核酸内切酶的 EcoRI 作为致死基因，使用肽聚糖生物合成途径的 MurC 作为目标必需基因。为了控制 MurC，一种称为 mf-Lon 的靶向蛋白质降解系统被用来特异性降解必需的 MurC 酶。这些杀伤机制与合成基因电路相结合，创造了 Deadman 和 Passcode 微生物杀伤开关。Deadman 杀伤开关基于不平衡的交叉调节转录调节因子，tetR 和 lacI，以及一种特定的诱导分子，ATc 被用作生存信号。在去除 ATc 后，两种杀伤机制都被激活，导致细胞死亡。Passcode kill switch 基于混合转录因子来灵活地改变生存信号的组合。通过诱导剂分子（包括 IPTG、半乳糖和纤维二糖）的正确组合，EcoRI 的表达和 MurC 的降解受到抑制，因此细胞得以存活。对于所有其他组合，密码电路触发了细胞死亡的两种杀伤机制。该系统将细胞活力降低到 10^-7 的检测限以下。（之前有考虑看过这篇文献，但是由于ATc（脱水四环素）直接放在土壤中会在程土壤微生物群的紊乱，便觉得不适合我们的课题。）

 
图1：Deadman
  
图2：Passcode

（3）结合所有三种杀伤机制，营养缺陷型系统、基于条件诱导系统和基于毒素的系统。删除用于生物素营养缺陷型的 bioAB、毒性基因 EcoRI 的整合以及必需基因（ribA、nadE、glmS 和 gmk）盒与诱导型启动子（PLtetO、PLlacO、PARa 和 PRha）的重建导致逃逸频率低于 1.3×10^-12 。

优点：

不同生物防护策略的组合通常显示出较低的逃逸频率和更高的杀伤效率。因此，该策略可用于限制微生物的传播，特别是对于需要抗释放遗传系统的转基因生物。

缺点：

仍然存在对工程微生物在细胞死亡后可能释放的遗传物质的担忧。因此，需要额外的保护措施来充分保护遗传材料或防止释放。

二、针对遗传物质

（一）基于毒素-抗毒素的质粒保护系统。

举例：

（1）将编码大肠杆菌素 E3 的毒性基因置于质粒上，将大肠杆菌素免疫基因置于染色体上。染色体中含有免疫基因的微生物可以复制质粒。如果天然存在的微生物接受了错误释放到开放环境中的质粒，则该质粒会激活大肠杆菌素 E3 并导致受体细胞死亡。

（2）使用 EcoRI 和 EcoRIM 作为毒素-抗毒素对构建质粒保护系统。为实现这一目标，他们将 EcoRI 基因置于质粒上，而将编码 EcoRI 甲基化酶的 EcoRIM 基因置于染色体上。这样，不含 EcoRIM 基因的细胞在接受含有 EcoRI 基因的质粒时无法存活。进一步构建一个改进的系统，结合之前的两个毒素-抗毒素对。将编码大肠杆菌素E3和EcoRI的基因整合到质粒中，将编码免疫E3和EcoRI甲基化酶的基因插入染色体。

优点：

毒素-抗毒素系统将有助于确保构建在质粒上的遗传物质免受水平基因转移。

缺点：

由于该系统依赖于毒素，毒素的异常表达可能导致细胞生长迟缓，并且毒素随机突变的高概率可以使保护系统失效。

（二）基于条件复制起点

条件复制起点 ColE2-P9 需要起始蛋白 Rep 来复制质粒 DNA。没有 Rep，宿主细胞无法复制含有 ColE2-P9 来源的质粒。将编码 Rep 蛋白的基因插入宿主染色体允许质粒在宿主细胞中复制，除了条件质粒外，可以再整合毒素-抗毒素系统或者营养缺陷机制以提高遗传物质的安全性。

优点：

与前面抗毒素系统相比，这个不会造成工程菌的生长抑制。

（三）基于 CRISPR-Cas

基于 CRISPR-Cas 的系统可以在基因水平上以序列特异性方式保护遗传物质，即使目标基因位于染色体上也是如此。CRISPR-Cas 系统识别目标序列并对其进行内源性切割。此功能用于在可能发生未经允许的释放的情况下分解目标基因。

卡连多等人。开发了一种靶向 DNA 降解装置，该装置基于 IE 型 CRISPR 系统。作为对阿拉伯糖诱导的响应，该系统降解了由向导 RNA 引导的目标序列。当目标序列在质粒上时，它显示出相对较低的失败率（10^-8）。另一方面，当目标基因位于染色体上时，该系统会导致宿主细胞死亡，逃逸率为

10^-8。

优点：

由于 CRISPR-Cas 系统通常对目标序列具有高度特异性，因此基于 CRISPR 的生物防护电路具有最小的副作用并且对细胞生长的影响可以忽略不计。此外，该系统活跃稳定，两个月后仍可正常运行，体现了系统的长期稳健性。

三、具有异种生物成分的生物防护系统

异种生物学侧重于使用 DNA、RNA 和氨基酸的非规范替代品或类似物的新生物系统。用于生物遏制的异种生物学方法探索独立运行且很少与自然生物系统相互作用的正交生物系统的发展。例如，非规范氨基酸 (NCAA) 、非标准碱基对和具有新型糖主链的核酸（异种核酸，XNA）存在于自然界中的物质被用作开发生物防护系统的基石。

与异种生物成分一起，复制、转录或翻译机制被直接进化为使用异种生物构建块。而自然存在的系统无法有效地整合异种生物成分这种复制、转录和翻译遗传密码的障碍可用于构建用于菌株和基因保护的新型生物防护系统。

（1）曼德尔等使用大肠杆菌 C321.ΔA 菌株，在该菌株中，他们为amber终止密码子分配了一个非规范氨基酸 L-4,4'-联苯丙氨酸 (bipA) 。通过对必需酶（Adk、AlaS、MetG、Pgk 和 TyrS）的计算重新设计，他们将非规范 bipA 分配给必需酶的关键残基，从而赋予工程菌株合成 bipA 依赖性。（需要bipA才能合成必需酶，如果质粒发生转移自然生物也不能也不能利用）通过这种方式，他们可以实现逃逸频率明显低于 10^-11 。

（2）此外，带有非天然碱基的 DNA 被用来控制宿主菌株的活力。马里埃等人。进化大肠杆菌创造了一种新菌株，可以用 5-氯尿嘧啶替代胸腺嘧啶。破坏 thyA 基因产生胸腺嘧啶营养缺陷型菌株，该菌株进一步进化为在 DNA 中掺入 5-氯尿嘧啶而不是胸腺嘧啶。因此，工程菌株由 A、G、C 和 5-氯尿嘧啶组成，并且只能在 5-氯尿嘧啶存在的情况下存活。

优点：

通过将琥珀密码子重新分配给 NCAA 而产生的合成营养缺陷型设计了仅依赖于 NCAA 存在的菌株生物防护系统。该系统表现出出色的逃逸频率，使其成为以消除工程化细胞为首要任务的应用的理想选择。

由于自然界中不存在 NCAA，因此依赖 NCAA 的生物防护系统可以避免营养缺陷型生物防护系统和基于条件必要性的生物防护系统在开放环境中可能遇到的交叉喂养问题，限制工程材料在自然环境中的传播，自然环境中的活生物体无法复制或转录由工程化的非天然碱基对和 XNA 组成的序列。当遗传物质水平转移时，此功能可防止该基因在其他生物体中发挥作用。

缺点：

异种基因保护仍处于起步阶段，由于尚未研究 NCAA 的生物相容性，因此在开放环境中使用 NCAA 仍然令人担忧。