文献分享
Quorum-Quenching Human Designer Cells for Closed-Loop Control
of Pseudomonas aeruginosa Biofilms
介绍
Introduction
越来越多的细菌被发现对抗生素产生了耐药性。其中，革兰氏阴性菌铜绿假单胞菌引起的伤口和肺部感染仍然是临床上的主要问题。铜绿假单胞菌的耐药性增强是因为生物膜的形成，以及由群体感应现象协调的大量微生物毒力因子的产生。因此，控制细菌群体感应，干扰生物膜的完整性是抑制铜绿假单胞菌耐药性的可行思路。合成生物学为实现该思路提供了以编程工程细胞为主的一系列技术手段。该团队以诱导群体淬灭关闭群体感应同时破坏菌体生物膜为目的设计了针对铜绿假单胞菌耐药性的工程细胞，同时对传感器传感效果、生物膜水解等重点功能进行了详尽的实验验证。
设计构想
Design
工程细胞的设计试想：关闭群体感应，产生群体淬灭，能够检测和对抗病原体。因此需要一种传感器来感应来自铜绿假单胞菌的自诱导物，也就是需要向细胞中导入非真核宿主固有的细菌通讯信号。铜绿假单胞菌主要通过两种信号分子高丝氨酸内酯（HSL）实现群体感应。细胞通透性假单胞菌自诱导因子1(PAI-1，3O-C12-HSL)帮助逃避免疫系统，调节促炎途径;自诱导因子PAI-2(C4-HSL)调控生物膜形成。因此以这两种HSL入手。转录激活因子LasR依赖于PAI-1开启活性，可用于构建输入模块。
群体淬灭系统
Design
图1. 群体淬灭系统的设计和原理。
感应&输入模块：假单胞菌自诱导传感器(Pseudomonas Autoinducer Sensor)PAiS是一个结构性表达的融合蛋白，包括来自单纯疱疹病毒的VP16反式激活域，以及核定位信号(NLS)和转录调节因子LasR（感应PAI-1）。该模块使HEK-293细胞能够监测铜绿假单胞菌产生的自诱导剂PAI-1(3O-C12-HSL)的水平。
异位表达的PAiS在被PAI-1激活后，能够与合成的PPA1启动子结合，该启动子具有启动子PhCMVmin上游的LasR特异操纵子位点，用来启动能够破坏生物膜的糖苷水解酶(PslGh和PelAh)和自诱导失活内酯酶(MomL)的表达。
PAiS传感效果验证
Experiment
图2. PAiS对自诱导物的传感效果验证。
A.将PAiS (VP16-NLS-LasR)表达载体和与启动子PPA1组装在一起的SEAP(人胎盘分泌型碱性磷酸酶；PPA1-SEAP-pA)或荧光胞浆蛋白TurboGFP(PPA1-TurboGFP-pA)一并转染HEK-293细胞。这里SEAP或TurboGFP作为报告基因发挥作用。PAI-1结合并激活PAiS，与PPA1启动子结合，启动SEAP或TurboGFP的表达。该线路用来证明PAiS对PAI-1的传感作用。
B.从传感系统的不同组合方式种挑选出最优组合。图中pSF144为报告基因（SEAP），pFS165是结构性表达启动子PSV40与PAiS（VP16-NLS-LasR）的组合，pFS158是PhEF1α与PAiS的组合,pFS145是PhEF1α与LasR-NLS-VP16的组合，pCK25则是PhEF1α-URS-pA。以上表达载体转染HEK-293细胞，培养24h后检测SEAP的表达。结果显示，pFS165和pFS158在10μM PAI-1存在下都表现出较高的表达水平。而pFS145没有，原因是VP16反式激活结构域的羧基末端融合导致融合蛋白失去了感应PAI-1的能力。
C.PAiSSEAP共转染(pFS165/pFS144)HEK-293细胞在不同PAI-1水平的培养液中培养24小时，然后检测SEAP水平。结果显示PAiSSEAP工程(pFS165/pFS144)HEK-293细胞对铜绿假单胞菌自诱导因子PAI-1具有微摩尔敏感性(EC50=1μM)，该浓度与铜绿假单胞菌分离株释放的水平相等。
D.将PhEF1α-PAiS和PPA1-SEAP转染不同的细胞株，PAI-1诱导24h后检测SEAP的表达。结果显示在HEK-193细胞中的效果最好。
E.培养PAiSSEAP41(1)HEK-293单克隆细胞群72 h，每24 h改变PAI-1水平(5μM)，显示PAiS系统中SEAP表达的可逆性。结果表明，该线路的激活是完全可逆的，而且可以通过添加和除去PAI-1来反复打开和关闭传感器。
F.PAiS对自诱导剂具有特异性，仅对铜绿假单胞菌产生的3O-C12-HSL和紫色色杆菌产生的C12-HSL响应。
G.实时监测PAI-1触发的PAiStGFP工程(pFS165/pFS160)细胞群的荧光，证实了PAiS对PAI-1具有高敏感性。
H.PAiStGFP工程细胞群暴露在PAI-1环境中不同时间产生的荧光强度，在荧光显微镜下观察。结果显示PAiS工程细胞在与PAI-1接触3小时即产生了荧光。
群体淬灭内酯酶的筛选
Experiment
下一步，通过将PAiS模块与群体感应自诱导剂灭活酶的表达联系起来，从而达到控制群体感应信号的积累的作用。通过以下实验从来自细菌和人的候选酶中选出最优酶。
图3. 群体淬灭内酯酶的筛选和验证。
A.群体淬灭内酯酶的筛选实验设计。将表达候选内酯酶的细胞用相同浓度的PAI-1处理30min，然后将上清液转移到PAiSSEAP细胞上，来检测上清液中PAI-1的剩余浓度，从而选择降解效果最好的酶。
B.以上实验的结果。其中优化后的内酯酶MomL的催化效果是最好的，表现出最低的SEAP水平，说明剩余的PAI-1最少。
C.同样的实验将PAI-1替换成PAI-2(C4 HSL)，MomL同样表现出最好的催化效果。
D.实验方法应同A。用不同浓度的PAI-1处理PAiSMomL工程细胞，上清液加入PAiSSEAP工程细胞，通过SEAP的浓度反应溶液中剩余的PAI-1水平，从而检验PAiSMomL的PAI-1依赖性，检验闭环的形成。
E.PAiSMomL的PAI-1依赖性。图片显示MomL的水平随PAI-1浓度的变化，结果显示PAI-1足以触发高剂量的MomL分泌（EC50 = 0.7μM）。
F.测试PAiS对铜绿假单胞菌释放的群体感应信号分子的感知和响应能力。观察到PAiS能够感知并响应铜绿假单胞菌释放的群体感应信号分子，体现在SEAP的水平高于对照组。对照组所用LasI-为缺陷型，不表达HSL。
G.PAiSMomL工程细胞与铜绿假单胞菌的共培养模型。将PAiSMomL工程细胞培养在可穿透性细胞培养小室的上层。下层是铜绿假单胞菌和肺上皮细胞。
H.图G的结果。通过检测培养液中的LDH，反映肺上皮细胞受铜绿假单胞菌的杀伤作用。结果显示，PAiSMomL工程细胞通过对自诱导物的降解将假单胞菌对肺上皮细胞的杀伤率降低了35%。几乎与对照组（结构性表达MomL的工程细胞）齐平。
生物膜水解验证
Experiment
针对顽固生物膜的合成群体淬灭级联反应的第二阶段。利用了铜绿假单胞菌外质糖苷水解酶PslG/PelA，从这两种酶中选择了催化糖苷水解酶结构域，并对它们进行了微调，以便在哺乳动物细胞中高效表达、分泌和稳定。
图4. 铜绿假单胞菌生物膜的水解。
A.通过糖苷水解酶和内酯酶的联合作用预防铜绿假单胞菌生物被膜。构建能分泌MomL(PhCMV-SSIgκ-FcmIg-MomL-pA，pFS218)、PslGh(PhCMV-SSIgκ-FcmIg-PslGh-pA，pTJ02)和/和PelAh(PhCMV-SSIgκ-FcmIg-PelAh-pA，pTJ01) 的HEK-293细胞，48h后将上清液(50%v/v)与铜绿假单胞菌混合。孵育24 h后，检测生物膜的形成。结果显示，在MomL,PslG和PelA的共同作用下，两种铜绿假单胞菌的生物膜都被削弱了。
B.对已经形成的铜绿假单胞菌生物膜的处理。用培养48h的工程细胞的上清液对预制的铜绿假单胞菌生物膜处理30min，用结晶紫对剩余生物膜进行定量。结果显示基本在30min内就分散了已经形成的生物膜。
C.群体淬灭工程细胞控制生物膜的形成实验示意图。在验证了三个模块的抗感染效果后，MomL、PslGh和PelAh被置于PAiS模块的控制下，从而最终完成了群体淬灭线路的设计。将导入该线路的工程菌培养在可穿透性细胞培养小室的上层，下层是铜绿假单胞菌。用来检测工程菌对生物膜形成的作用。
D.上述实验的结果。培养24h后，结果显示该工程细胞能够使铜绿假单胞菌生物膜的量减少一半。
抗生素耐药性抑制验证
Experiment
图5. 群体淬灭工程菌增强抗生素对生物膜的控制效果。
A.构建分泌MomL(PhCMV-SSIgκ-FcmIg-MomL-pA，pFS218)、PslGh(PhCMV-SSIgκ-FcmIg-PslGh-pA，pTJ02)和PelAh(PhCMV-SSIgκ-FcmIg-PelAh-pA，pTJ01)的HEK-293细胞，培养48h后，上清液与铜绿假单胞菌PA01混合培养24 h。用不同浓度的妥布霉素处理后检测生物膜的形成。结果显示，2μg/mL妥布霉素对铜绿假单胞菌的杀伤力，工程细胞组是对照组(pEGFP-N1)细胞的9倍。
B.共培养模型。同时用群体淬灭工程菌和抗生素处理铜绿假单胞菌。
C.上述实验的结果。用群体淬灭工程细胞和妥布霉素共同处理的铜绿假单胞菌，在24小时内阻止了生物膜的形成。减少了细菌的深谷无量，阻止了细菌的附着。
D.共培养24h后用结晶紫染色显示生物膜的形成。结果显示，与单独使用抗生素相比，群体淬灭和抗生素的联合使用有效地阻止了生物膜的形成。
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