iGEM课题分享——2024 CJUH-JLU-China

Heartecho

iGEM课题分享

iGEM 2024 CJUH-JLU-China

01、获奖情况

在2024年iGEM大赛中，CJUH-JLU-China获得金牌并荣获最佳诊断项目奖、最佳建模奖、最佳综合人类实践奖、最佳教育奖、最佳网页奖5个最佳单项奖提名。

02、Background ckground

——BACK TO SCHOOL——

心血管疾病和癌症是全球死亡的主要原因，每年分别导致约1790万人和960万人死亡，且两者之间存在许多共同的风险因素。

心血管疾病患者患癌症的发病率逐年增加，比无心血管疾病的患者高出13%，这表明两者之间可能存在某种关联。ReverseCardio-Oncology是心血管和癌症交叉领域的一颗新星，致力于研究心血管疾病在癌症发生和发展中的作用和机制。

近年来，越来越多的研究和发现推动了该领域的发展，为理解心血管疾病和癌症之间的联系提供了更有力的科学依据。该团队开发的诊断工具Heartecho，采用基于LIRA的AND逻辑门系统，并结合无细胞系统显示结果，为心肌梗死患者提供了快速、简便的癌症风险预警方法，有助于改善患者的预后和延长生存期。

03、Principle

——BACK TO SCHOOL——

1. miRNA

miRNA是一类小的非编码RNA，通常长度为21-23个核苷酸，在基因调控中起着至关重要的作用。miRNA通过与靶标mRNA的3'端非编码区域进行碱基配对来下调基因表达，从而控制真核生物的细胞过程。

2. LIRA检测技术

（1）单臂

Loop-Initiated Isothermal RNA Activator（LIRA）是一种基于RNA二级结构的新型RNA检测技术，其的单臂结构由一个环和互补配对茎组成，其识别域分为位于茎（b*）和环（a*）上的两部分。LIRA隐藏了茎环结构内RNA翻译所需的核糖体结合位点（RBS）序列和起始密码子AUG。当靶标miRNA存在时，它与LIRA识别结构域结合，破坏其原始结构并暴露RBS和AUG，从而启动下游报告基因的翻译。

（2）双臂

该团队在单臂设计的基础上，基于逻辑“AND”条件，设计了AND-Gate，即仅当miRNA-A与miRNA-B同时存在时才启动下游目标基因的表达，

3. 显色法

团队使用LacZ替换LIRA的下游基因，使检测能够可视化。LacZ能够与CPRG反应产生紫色物质。当LIRA系统中LacZ的翻译由两个miRNA启动时，产物β-半乳糖苷酶催化CPRG底物发生颜色反应，溶液变为紫色（阳性），黄色则代表基因未表达（阴性）。

04、Design

——BACK TO SCHOOL——

1.验证已建立的 LIRA 系统的有效性：

根据文献“ Multi-arm RNA junctions encoding molecular logic unconstrained by input sequence for versatile cell-free diagnostics. ”选择 H01 和 H05两个已被报道具有优异的性能的 LIRA 验证 LIRA 是否能有效地检测其靶 RNA。

验证过程包括：将含或不含 Input RNA 的 LIRA 质粒转化为 BL21-DE3 用于蛋白质表达，并通过抗生素抗性选择和核酸内切酶消化验证了成功转化，用IPTG 诱导来激活 T7 启动子并控制反应时间，超声破碎 IPTG 诱导的 BL21-DE3 获得蛋白质样本，使用 Western Blot 和 SDS-PAGE检测 LIRA 下游的蛋白基因 EGFP 是否可以表达，测量 EGFP 蛋白的荧光，以定量评估 LIRA 的有效性。

使用 On/Off ratio 来评估 LIRA 的有效性。（LIRA 的开/关比是指 On-state 报告基因表达，即在相应输入 RNA 存在下 LIRA 介导的下游基因表达，除以 Off-state 报告基因表达）

2.鉴定某些 miRNA 作为理想的生物标志物：

通过生物信息学方法，发现 miR-210-3p 和 miR-142-3p 在 MI 后患者中高表达。

Transwell 实验，以评估侵袭水平是否会受到 miR-142-3p 和 miR-210-3p 的影响；细胞划痕实验，以评估迁移水平是否会受到 miR-142-3p 和 miR-210-3p 的影响。通过两种实验验证 miR-210-3p 和 miR-142-3p 是否可以促进癌症进展。

3.设计和开发靶向这些 miRNA 的 LIRA：

在设计过程中，发现文献报道的案例不同，文献中使用的靶 RNA 是 31nt，而该团队使用的靶 miRNA 分别为 22nt 和 23nt。由于长度不同，无法直接使用文献中报道的 LIRA 设计方式。为确定识别区域，定义了一个 stem-loop 的概念 ratio：茎结构中识别区核苷酸数量与环结构中识别区核苷酸数量之比。

因此，该团队设计了具有不同茎环比的单臂 LIRA 的有效性，测试了靶向 miR-210-3p 和 miR-142-3p 的 3 个双臂 LIRA 的有效性。

同样以EGFP 基因作为下游报告基因，通过通过荧光测量检测 LIRA 介导的蛋白表达。

4.建立无细胞检测系统：

为实现应用，将 LacZ 编码序列与作为报告基因的 LIRA 联系起来，制备了双臂 LIRA 质粒，用于在无细胞系统中表达 LIRA，添加 CPRG（黄色）作为底物，它可以被 LacZ 酶转化为 CPR（紫色）。

05、r- Reslut

1.验证已建立的 LIRA 系统的有效性：

根据文献“ Multi-arm RNA junctions encoding molecular logic unconstrain- ed by input sequence for versatile cell-free diagnostics. ”

选择 H01 和 H05两个已被报道具有优异的性能的 LIRA 验证 LIRA 是否能有效地检测其靶 RNA。

根据文献中提供的序列合成携带 H01 和 H05 LIRA 的质粒。

（1）质粒 DNA 的扩增和检查：

H01、H05为LIRA体系，Input01、Input05为分别对应H01、H05的靶RNA。

将这些质粒转化到 DH5-α 中进行扩增。转化的克隆在 LB 培养基中生长。通过大量提取来自这些克隆的质粒 DNA，并用核酸内切酶消化。通过琼脂糖凝胶电泳分析消化的质粒 DNA，证明这些质粒的大小是正确的。

（2）将 LIRA 和输入 RNA 质粒转化到 BL21-DE3 中：

为了生成同时具有LIRA质粒及其相应输入质粒的克隆，将H01+input01和H05+input05质粒共转化到BL21-DE3中（以T7 RNA聚合酶为表达系统，能够高效表达克隆于含有噬菌体T7启动子的表达载体的基因）。通过以下方法提取转化的 BL21-DE3 质粒 大提，并被核酸内切酶消化。琼脂糖凝胶电泳 消化的质粒显示H01 + input01 & H05 + input05 质粒共转化成功。

（3）EGFP 表达检查：

为了比较 BL21-DE3 克隆中 EGFP 与 LIRA 质粒、H01 和输入 01 或 H05 与输入 05 的表达，所有 BL21-DE3 克隆均通过用 IPTG 0.1 mM 在 LB 中培养转化的 BL21-DE3 蛋白 4 小时进行 EGFP 蛋白的 IPTG 诱导（BL21-DE3 中 T7 RNA 聚合酶的转录受 lacUV5 启动子调节。

携带 H01 和 H05 LIRA （pCOLADuet-1） 的质粒具有编码 Lacl 蛋白的基因，该基因可以抑制 lacUV5 启动子。因此，将 H01 和 H05 质粒转化为 BL21-DE3 会抑制任何需要 T7 RNA 聚合酶的转录。IPTG 可与 LacI 蛋白结合，并在 lacUV5 启动子上释放对 LacI 蛋白的抑制，从而激活 T7 RNA 聚合酶的转录）。

IPTG 诱导后，超声破碎处理 H01 和 H05 转化的 BL21-DE3 克隆，并对细胞裂解物进行 SDS-PAGE 和 Western Blot 分析。

H01

SDS-PAGE和Western Blot 结果显示，H01+input01 转化的 BL21-DE3 克隆中 EGFP 蛋白的表达远高于 H01 转化的 BL21-DE3 克隆，且有IPTG诱导条件下EGFP表达量远高于无诱导条件，表明 Input01 RNA 成功改变了 H01 的结构，并暴露了 H01 中的 RBS 和起始密码子，用于翻译下游 EGFP。

H05

SDS-PAGE和Western Blot 结果显示，虽然有IPTG诱导条件下EGFP表达量远高于无诱导条件，但 IPTG 诱导的 H05+input05 EGFP表达仅略高于 IPTG 诱导的 H05，表明 Input05 RNA 可能略微改变 H05 的结构，并在 H05 中暴露 RBS 和起始密码子以翻译下游 EGFP。

该结果表明，靶向 input01 RNA 的 H01 LIRA 的有效性远高于靶向 input05 RNA 的 H05 LIRA。

（4）荧光测量：

为了定量 LIRA 介导的 EGFP 表达，通过多功能酶标仪测量了来自所有 BL21-DE3 克隆的蛋白质裂解物的荧光。为了定量比较 H01 和 H05 的有效性，使用 On/Off 比率（LIRA 的开/关比定义为 ON-state 报告基因表达，即在相应输入 RNA 存在下 LIRA 介导的下游基因表达，除以 OFF-state报告基因表达）判断。

 

IPTG 诱导的 H01+input05 EGFP表达远高于 IPTG 诱导的 H01， IPTG 诱导的 H05+input05 EGFP表达仅略高于 IPTG 诱导的 H05。

H01 的开/关比为 28.554，而 H05 的开/关比为 1.345。比较 H01 和 H05 的荧光测量结果，H01 的开/关比远大于 H05，表明 H01 是一种更有效的 LIRA。因此，该团队决定在 H01 的结构基础上开发自己的 LIRA。

2.确定用于 CVD 患者癌症筛查的靶标 miRNA：

使用各种生物信息学分析，模型组确定了 miR-142-3p 和 miR-210-3p 是心肌梗死后患者癌症筛查的理想生物标志物。我们做了细胞划痕实验和 Transwell 实验确认这两种 miRNA 可以促进迁移和癌细胞的侵袭。

（1）单臂 LIRA 测试：

在设计过程中，发现文献报道的案例不同，文献中使用的靶 RNA 是 31nt，而该团队使用的靶 miRNA 分别为 22nt 和 23nt。由于长度不同，无法直接使用文献中报道的 LIRA 设计方式。为确定识别区域，定义了一个 stem-loop 的概念 ratio：茎结构中识别区核苷酸数量与环结构中识别区核苷酸数量之比。

A.靶向 miR-142-3p 的单臂 LIRA 测试:

模型组设计了靶向 miR-142-3p 的单臂 LIRA。 选择了 3 个 LIRA 用于评估的不同茎环比。将这些 LIRA 克隆到 pCOLADuet-1 的 pCOLADuet-1 中，并将这些构建体命名为 H142_3/20、H142_8/15 和 H142_11/12 分别。此外，我们还克隆了 miR-142-3p 注入质粒 pCDFDuet-1 和 pET-15b 中，表达 miR-142-3p，并将这些构建体命名为 input142。

转化的 BL21-DE3 克隆用 0.1 mM IPTG 处理 4 h，然后用超声破碎。离心收集细胞裂解物并稀释至 1.8 μg/μL。在中高 PMT 增益下测量稀释细胞裂解物的 EGFP 荧光。结果表明，用 H142_11/12 和 input142 转化的克隆的 EGFP 表达高于其他克隆。

此外，计算了不同茎环比（H142_3/20、H142_8/15 和 H142_11/12）的 LIRA 的 On/Off 比值，发现 H142_11/12 具有最大的 On/Off 比值，表明 11/12 可能是靶向 miR-142-3p 的 LIRA 的最佳茎环比。

B.靶向 miR-210-3p 的单臂 LIRA 测试：

模型组还设计了靶向 miR-210-3p 的单臂 LIRAs，选择了 3 个具有不同茎环比的 LIRA 进行评价。将这些 LIRA 克隆到 pCOLADuet-1 中，并将这些构建体分别命名为 H210_2/20 、 H210_7/15 和 H210_10/12。此外，我们将 miR-210-3p 序列克隆到质粒 pCDFDuet-1 和 pET-15b 中以表达 miR-210-3p，并将这些构建体命名为 input210。

转化的 BL21-DE3 克隆用 0.1 mM IPTG 处理 4 h，然后用超声破碎。离心收集细胞裂解物并稀释至 1.8 μg/μL。在中高 PMT 增益下测量稀释细胞裂解物的 EGFP 荧光。结果表明，用 H210_2/20 和 input210 转化的克隆的 EGFP 表达高于其他克隆。

此外，计算了不同茎环比的 LIRA 的 On/Off 比值，即 H210_2/20、H210_7/15 和 H210_10/12，发现 H210_2/20 具有最大的 On/Off 比值，表明 2/20 可能是靶向 miR-210-3p 的 LIRA 的最佳茎环比。

(2)针对两者的双臂 LIRA 测试：

目标是验证设计的靶向 miR-210-3p 和 miR-142-3p 的双臂 LIRA。此双臂 LIRA 有两个识别区域，用于两个不同的靶标 RNA 和理想的 LIRA 只能在两者存在的情况下被激活 这两个靶 RNA。

模型组分析了序列和结构，并使用多个指标来计算 LIRA 的预期分数来预测其有效性，选择了 3 双臂 LIRA 和 不同的期望分数来测试它们对检测的有效性 miR-210-3p 和 miR-142-3p。

将这些 LIRA 克隆到 pCOLADuet-1 中，并将这些构建体分别命名为双臂 LIRA 1 、 双臂 LIRA 2 和双臂 LIRA 5。

转化的 BL21-DE3 克隆用 0.1 mM IPTG 处理 4 h，然后用超声破碎。离心收集细胞裂解物并稀释至 1.8 μg/μL。在中高 PMT 增益下测量稀释细胞裂解物的 EGFP 荧光。

即使同时使用 input142 和 input210，用双臂 LIRA 1 转化的克隆也没有增加 EGFP 表达，表明它不能被 miR-142-3p 和 miR-210-3p 激活。

双臂 LIRA 2 转化的克隆显示，即使单独使用 input142 也显示 EGFP 表达增加，表明它可以被单独 miR-142-3p 激活。

双臂 LIRA 5 转化的克隆仅在 input142 和 input210 下显示 EGFP 表达增加，表明它只能在 miR-142-3p 和 miR-210-3p 存在下被激活。

根据结果，选择使用LIRA 5。

3.无细胞系统测试：

未来，希望应用基于 LIRA 的筛查方法来筛查 MI 后患者的血液样本，以识别那些癌症高危患者。由于不太可能将血液样本中的 miRNA 转化为细菌（易降解、难识别、难扩增），因此需要将基于 LIRA 的筛选方法调整为无细胞系统。此外，对于筛选方法，检测颜色变化比 EGFP 的表达要容易得多，EGFP 需要机器测量荧光。因此，着手对基于 LIRA 的筛查方法进行两项改进。将报告基因从 EGFP 更改为 LacZ，这可以将 CPRG（黄色）水解成 CPR（紫色）。

为了建立 LIRA 的无细胞系统，首先尝试了 H01 LIRA，一开始就已经在实验中成功验证了它。在 H01 LIRA 构建体中将报告基因从 EGFP 替换为 LacZ。对于无细胞系统，选择了 New England BioLabs 的 PURExpress® 体外蛋白质合成系统。以 CPRG 为底物，可以可视化 LacZ 表达的结果。

接下来，我们将双臂 LIRA 5 与 LacZ 报告基因相结合，并使用无细胞系统对其进行测试。我们将带有 miRNA 和 CPRG 的双臂 LIRA 5 质粒添加到无细胞系统中。在 37°C 下孵育 2 小时后，结果可以可视化，也可以通过使用多功能酶标仪测量 OD562 进行定量。

β半乳糖为对照组，颜色偏紫红，同时存在miR-142-3p 和 miR-210-3p时颜色发生明显变化， 偏橙红，其 余组不变色，均为黄色。

结果表明，我们的双臂 LIRA 5 可以被 无细胞系统中的 miR-142-3p 和 miR-210-3p激活，在无细胞系统中表达LacZ报告基因。

06、Model

——BACK TO SCHOOL——

1. 确定癌症筛查的目标 miRNA

他们在 GEO 数据库中筛选与心肌梗死（MI）、心力衰竭（HF）相关的 miRNA 数据集，并在 TCGA 数据库中分析多种癌症的 miRNA 表达情况。经筛选和对比，发现 miR - 210 - 3p 和 miR - 142 - 3p 在 MI 患者和多种癌症中均显著上调，且通过 ROC 曲线评估，二者联合检测能降低假发现率。

HF 和癌症数据库中 miRNA 分析的流程图

2. 验证 miRNA 功能

通过文献调研发现这两种 miRNA 与癌细胞迁移和侵袭相关，将其模拟物和抑制剂转染至人肾透明细胞癌细胞系786-o细胞，经Transwell和Wound Healing实验证实，miR-210-3p和miR-142-3p可促进癌细胞迁移和侵袭 。

miR-210-3p转染的786-o细胞的Wound Healing检测

miR-142-3p转染的786-o细胞的Transwell检测。

3. 设计单臂 LIRA

依据 LIRA 的结构和工作原理，确定各部分组成并替换识别区域序列，利用NUPACK 软件设计和分析序列。针对目标 miRNA 长度差异，尝试不同茎环比设计 LIRA 结构，分析杂交过程中的自由能变化，最终选定部分 LIRA 序列用于后续实验。

单臂 LIRA 设计的参数设置

4. 设计双臂 LIRA

为同时靶向两种 miRNA，设计具有双识别区域的双臂 LIRA。利用 NUPACK 软件设计并模拟 100 个双臂 LIRA，经筛选和优化，得到 6 个符合设计预期的 LIRA 序列。

双臂 LIRA 设计的参数设置

5. 优化双臂 LIRA

通过多元回归分析发现指标间存在强共线性，遂使用随机森林算法训练指标。结果显示 “unlock divide lock weighted” 指标预测效果最佳，根据该指标计算各 LIRA 的 “expectation” 值并排序，选定 LIRA 序列 2 和 5 用于湿实验。

"lock" and "unlock"计算过程图

6.分析 LIRA 介导的反应

分别对单臂和双臂 LIRA 在细胞内、外的反应进行模拟，写出化学反应方程并转化为 ODEs，收集参数值后用 MATLAB 求解，得到报告基因 EGFP 的浓度变化曲线和峰值时间等信息。

改变 miR - 210 - 3p 和 miR - 142 - 3p 的浓度进行模拟，用二次回归拟合数据得到回归方程，并通过 ANOVA 分析验证模型。结果表明，EGFP 表达随两种 miRNA 浓度增加而升高，且在特定浓度范围内有最佳检测效果，为 LIRA 检测试剂盒的应用提供参考。

07、HP

——BACK TO SCHOOL——

该项目的HP部分围绕 “Heartecho” 项目的立项、设计、优化展开。在项目启动阶段，他们受心血管疾病高死亡率启发，通过与医生交流确定研究方向。在项目设计与优化阶段，他们参与学术会议、咨询专家并利用生物信息学筛选生物标志物，同时考量伦理因素并与患者沟通获取反馈。

在商业规划方面，他们分析市场需求和潜力，制定商业模式、进行 SWOT 分析并寻求多方验证；还积极履行社会责任，举办体育活动宣传健康知识、发表综述文章和制定伦理手册，多维度推进项目发展。以此实现为心肌梗死患者提供癌症早期筛查工具，推动逆向心脏肿瘤学领域的进步的目标。